© PERIYANNAN RESEARCH GROUP
Gradientengele sind eine feine Sache. Wer schon einmal mit ihnen gearbeitet hat, kennt ihre Vorzüge gegenüber Gelen mit fester Acrylamid-Konzentration. Zur Erinnerung: Bei Gradientengelen nimmt die Acrylamid-Konzentration innerhalb des Gels linear oder in Stufen zu, die Porengröße wird also entsprechend kleiner.
Mit diesen Gelen kann man gleichzeitig Proteine mit niedrigen und hohen Molekulargewichten auftrennen. Im Idealfall lösen sie die unterschiedlichen Proteine und Proteinfragmente auch dann noch auf, wenn diese ein sehr ähnliches Molekulargewicht aufweisen. Zudem sind die Banden schärfer, weil der vordere Teil des wandernden Proteins durch die kleiner werdenden Poren stärker gebremst wird als der hintere Teil.
Teure Fertig-Gradientengele
Doch wäre es zu schön um wahr zu sein, hätte nicht auch diese Methode einen Haken: Kommerziell erhältliche, fertig gegossene Gradientengele sind teuer. Für kleine Labore oder für die Lehre kommen sie kaum in Frage. Gradientengele selbst herzustellen, insbesondere Gele mit linearem Gradienten, ist aber ziemlich tricky und zeitintensiv. Nichts, was man so mal nebenher machen könnte.
Dass es aber auch einfach geht, zeigt die Gruppe des Neurobiologen Eric Norstrom von der DePaul University in Chicago (Miller et al., Anal. Biochem. 509, 12-14). Norstroms Team forscht am Amyloid Vorläuferprotein (Amyloid Precursor Protein, APP) und dessen Derivaten, die eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie von Morbus Alzheimer spielen. Das Problem dabei: Das Molekulargewicht von glykolisiertem APP liegt über 100 kD, das der Spaltprodukte aber zum Teil unter 10 kD. Zusätzlich unterscheiden sich letztere in einigen Fällen nur um 2 kD. Für Norstrom und Co. kam also nur ein Gradientengel für die Gelelektrophorese von APP in Frage. Klar, dass sie dieses selbst herstellen wollten und zwar möglichst unkompliziert. Und tatsächlich fanden Miller et al. eine verblüffend schnelle und einfache Methode zur Herstellung von Gradientengelen.
Für diese benötigt man eine serologische Pipette, eine Gießkammer sowie Gelpuffer mit unterschiedlichen Acrylamidkonzentrationen - das war's.
Zuerst zieht man mit der Pipette das gewünschte Volumen des niedriger konzentrierten Gels auf, danach mit der gleichen Pipette das Gel mit der höheren Konzentration. Möchte man ein Stufengradientengel gießen, entlässt man den Pipetteninhalt direkt in die Gießkammer. Diese ist also unten mit dem höher konzentrierten Acrylamid-Gel befüllt, das Gel mit der niedrigen Konzentration liegt über dieser Schicht. Nach den Angaben von Miller et al. vermischen sich die beiden Phasen so gut wie nicht.
Kein perfekter Gradient aber gut genug
Will man hingegen ein Gel mit linearem Gradienten gießen, zieht man nach den beiden Gel-Lösungen noch ein bis zwei Luftblasen auf. Wandern diese durch die Pipette nach oben, vermischt sich die stärker konzentrierte Gel-Lösung zunehmend weniger mit der schwächer konzentrierten. Das ergibt zwar keinen ganz astreinen linearen Gradienten, für viele Anwendungen ist dies aber auch nicht nötig.
Und wie schneiden die Do-it-Yourself-Gradientengele im Vergleich mit kommerziellen Gelen ab? Um dies herauszufinden, trennten die Wissenschaftler aus Chicago einen Molekulargewichts-Marker mit großer Bandbreite sowie ein HEK293-Zelllysat in einem gekauften Gel mit 10% beziehungsweise 4 bis15% Acrylamid sowie in einem selbst hergestellten Gradientengel mit 4 bis15% Acrylamid. Beide Gradientengele separierten die Proteine wesentlich besser, als das Gel mit der festen Acrylamidkonzentration, wobei das Bandenmuster bei beiden Gradientengelen vergleichbar war.
Prinzipiell sollten die von Miller et al. gegossenen Gradientengele also funktionieren. Die Gruppe wollte es jedoch genauer wissen und setzte ihre DIY-Gradientengele für die Analyse von APP ein. Hierzu gaben Norstroms Mitarbeiter APP, inklusive der APP-Derivate, auf ein Tris-Tricin-Stufengradientengel mit 10 bis16% Acrylamid. Tatsächlich gelang es der Gruppe mit dem selbst gegossenen Gradientengel sowohl APP (78,7 kDa), als auch die C-terminalen Fragmente C83 (9,2 kDa) sowie C99 (11,1 kDa) eindeutig voneinander zu trennen und nachzuweisen.
Solange die eingesetzten Volumina der beiden Gel-Lösungen konstant bleiben, sollten Forscher mit den selbst hergestellten Gradientengelen reproduzierbare Ergebnisse erzielen. Die Methode ist nicht nur einfach und erlaubt auch Anfängern Gradientengele selbst zu gießen und dadurch Kosten zu sparen. Biowissenschaftler können mit ihr auch maßgeschneiderte Gele mit unterschiedlichsten Gradienten fertigen, die speziell auf ihre Forschung zugeschnitten sind.
Irene Doering