„Optoptosis“ lautete der von den Rheinländern gewählte Projekttitel. Ganz nach dem Motto „Licht an, Krebs aus“. Wie auch bei den anderen teilnehmenden Teams hatte deren iGEM-Bewerbung einen langen Vorlauf von rund einem Jahr. Die Studenten, die sich hierzu zusammengefunden hatten, waren allesamt sehr jung; zum Zeitpunkt der Bewerbung war niemand älter als 23, so dass Düsseldorf als einziges Team aus dem deutschsprachigen Raum in der Altersklasse „Undergraduate“ antrat.
Carolin Krämer etwa war, wie viele andere ihrer Mitstreiter, gerade mal im dritten Semester des Biologie-Bachelor-Studiengangs. Trotzdem haben nicht irgendwelche Betreuer die Projektidee entwickelt, beteuert das Team. „Der Vorschlag kam von René“, erinnert sich Krämer, und das sei gewesen, bevor sie überhaupt ihren Projektbetreuer an Bord hatten. „Wir haben erst im Nachhinein erfahren, dass wir hier an der Uni Matias Zurbriggen haben, einen Experten für Synthetische Biologie, der viel mit Optogenetik arbeitet.“ „Der ist zu dem Zeitpunkt auch gerade erst nach Düsseldorf gekommen“, ergänzt Krämers bereits erwähnter Kommilitone René Inckemann. Das sei ein glücklicher Zufall gewesen.
Glücklicher Zufall
Nun ist der Gedanke natürlich nett, Tumorzellen mit optogenetischen Mitteln zuleibe zu rücken. Um bei iGEM zu überzeugen, braucht es aber ein schlüssiges Gesamtkonzept, wie sich die Idee tatsächlich in die klinische Realität überführen ließe. Und Proof of Concept-Experimente, die zumindest für ein paar Komponenten des molekularen Anti-Krebs-Baukastens zeigen, dass sie in der Therapie funktionieren könnten.
So viel sei an dieser Stelle bereits verraten: Düsseldorf hat sich eine Goldmedaille gesichert; und die bekommt man nur, wenn die Juroren überzeugt sind und das Team eine Reihe von Anforderungen und Zusatzaufgaben gemeistert hat.
Gearbeitet haben die Düsseldorfer vor allem an HeLa-Kulturen, in die sie ihr Genkonstrukt mit dem lichtabhängigen Apoptoseschalter eingebracht hatten. In der klinischen Anwendung sollen es irgendwann einmal Virushüllen sein, die die Genkassetten zielgenau in die bösartigen Zellen transportieren. „Viren kann man ziemlich spezifisch auf Krebszellen abrichten“, erklärt Inckemann. Im Rahmen von iGEM habe die Zeit dazu leider nicht gereicht, die eigenen Plasmide mit den Konstrukten in Kapside zu verpacken, die als Taxi in die richtigen Zellen dienen.
Mit Viren und Lichtkabeln
Die umgebauten Viren könnten die Tumorzellen an ihren Oberflächeneigenschaften erkennen, die man sich ja auch bei Antikörper-Therapien gegen Krebs zunutze macht. Leider haben Tumorzellen die unangenehme Eigenschaft, ihre Oberflächenmerkmale schnell zu ändern, so dass ein vormals geeigneter Antikörper nach einiger Zeit nicht mehr passt. Für die Therapie aus Düsseldorf hingegen müsste man die Viren mit den therapeutischen Lichtschaltern nur ein einziges Mal verabreichen. Dann – so zumindest der Plan – wäre jede Krebszelle mit dem Konstrukt infiziert. Geht nun das Licht an, wird nicht das gesamte Gewebe geschädigt, sondern es gehen selektiv nur die Krebszellen in die Apoptose.
Wie aber soll das Licht in den Tumor gelangen? „Das ist eine gute Frage“, meldet sich Marvin Hubert zu Wort, ein weiterer Bio-Student aus dem Team. „Insbesondere blaues Licht dringt nämlich nur wenige Millimeter in den Körper ein. Rotes Licht geht dagegen ein bisschen tiefer, und da könnte man Upconversion Nanoparticles einsetzen.“ Das entsprechende Prinzip: Spezielle Partikel fangen viele energiearme „rote“ Photonen ein und machen daraus wenige energiereiche „blaue“ Photonen. Bekäme ein Patient diese Nanopartikel verabreicht, könnte man ihn mit langwelligem Licht bestrahlen, das tief ins Gewebe eindringt und danach erst ins kurzwellige Spektrum „konvertiert“ wird.
Hubert räumt ein, dass hier noch viel Forschung nötig sei. „Unser Hauptgedanke ist daher, dass man bei minimal-invasiven Eingriffen Glasfaserkabel einsetzt, um das betroffene Gewebe mit Licht zu bestrahlen.“ Was umständlich klingt, sei in optogenetischen Tierversuchen längst gang und gäbe, ergänzt Inckemann: „Das sind keine fetten Kabel, sondern die sind dünner als ein Haar – und man bringt die auch schon in Mäusehirne ein, um spezielle Neurone per Optogenetik zu aktivieren. Das ist also mehr als nur eine Zukunftsvision.“
Expression durch Rotlicht
Kommen wir zum Kernstück der Rheinländer – nämlich dem eigentlichen Gen-Konstrukt, das in den Krebszellen landen soll. Eine Komponente ist ein Schalter, der auf Rotlicht reagiert und dann Bax exprimiert – ein Protein, das Apoptose einleitet. Normalerweise bleibt das eingebrachte Bax-Gen inaktiv, denn der in diesem Fall notwendige Transkriptionsfaktor VP16 findet keine Bindestelle am Bax-Promotor. VP16 ist aber fusioniert mit dem lichtempfindlichen Phytochrom B (PhyB) aus Arabidopsis. Unter Rotlicht ändert PhyB seine Konformation und kann sich jetzt anlagern an Pif6 – ebenfalls ein aus Arabidopsis entliehenes Protein. Pif6 wiederum ist fusioniert an einen Tetracyclin-Repressor. Und der erkennt eine spezifische DNA-Sequenz, die die Düsseldorfer genau vor das Bax-Gen platziert haben. Einfach gesagt: Nur bei rotem Licht bildet der Bax-Transkriptionsfaktor einen Komplex mit einem TetR-Fusionsprotein und findet so erst seinen Platz am Bax-Promotor. Und dann wird das Bax-Gen abgelesen.
Um sehen zu können, wann die Zellen Bax herstellen, ist rotfluoreszierendes mCherry an Bax fusioniert. Außerdem verwenden die Rheinländer eine leicht modifizierte Bax-Variante. „Bax löst nur dann Apoptose aus, wenn es an die Mitochondrienmembran gelangt“, erklärt Inckemann. Und die Düsseldorfer Bax-Version hat eine zu geringe Affinität zur Mitochondrienmembran, um die Zellen in den Selbstmord treiben zu können. Eine Sicherheitsvorkehrung, falls die Konstrukte doch in andere Zellen im Körper gelangen. „In der Natur ist nie etwas zu hundert Prozent an- oder ausgeschaltet“, begründet Inckemann. „Wir wollen verhindern, dass auch in Zellen etwas passiert, die gar nicht mit Licht bestrahlt worden sind!“
Sicherheitsvorkehrung
Als Sicherheitsnetz gibt es daher noch einen Blaulichtschalter – die zweite Komponente im Optoptosis-Konstrukt. Blaulicht aktiviert die Domäne eines weiteren synthetischen Proteins, und das ist in der Mitochondrienmembran verankert. Erst jetzt kann das modifizierte Bax daran binden und das Ableben der Zelle einleiten. Auch dieser Blaulichtschalter enthält mit LOV2 ein Protein, das eigentlich aus der Ackerschmalwand stammt.
Experimente an HeLa-Zellen seien vielversprechend verlaufen, berichtet Marvin Hubert. „Was wir auf jeden Fall gesehen haben, ist, dass die rotlichtabhängige Expression funktioniert. Im Dunkeln sehen wir dagegen keine Produktion des Fusionsproteins.“ Den Blaulichtschalter konnten die Forscher an seiner grünen Fluoreszenz dank GFP erkennen, und auch der war exprimiert. „Wir haben auch gesehen, dass Grün und Rot an denselben Stellen lokalisiert waren“, schildert Inckemann die Beobachtungen nach Bestrahlung mit zunächst rotem und anschließend blauem Licht. Demnach hat Bax wohl seinen Platz auf der Mitochondrienmembran gefunden.
Zu wenig Zeit
Die Zeit für apoptotische Assays habe am Ende leider gefehlt. „Aber wir hatten tote Zellen“, resümiert Inckemann. Offenbar funktionieren die Schalter also zumindest in Zellkultur wie erwartet. Allein unter blauem Licht komme es hingegen nicht zum Zellsterben. Dazu habe man auch Kontrollversuche mit Plasmiden ohne die lichtempfindlichen Konstrukte gemacht – um auszuschließen, dass die HeLa-Zellen einfach nur durch das experimentelle Prozedere sterben.
Den Düsseldorfern fehlt momentan die Zeit, ihr Projekt weiter zu verfolgen, so dass auch Optoptosis wohl nur eine originelle Idee bleibt – so wie viele andere iGEM-Projekte. Carolin Krämer weist aber darauf hin, dass die „BioBricks“, die von allen Teams gebastelten Plasmide, Allgemeingut sind. „Im Prinzip kann sich jedes Labor als Partner anmelden, um iGEM-Material anzufordern und zu verwenden; dazu muss man nicht am Wettbewerb teilgenommen haben!“
Vielleicht findet der Lichtschalter gegen Krebs auf diese Weise doch noch seinen Weg von der Zellkultur in die Klinik.
Mario Rembold
Mehr über einige der deutschen iGEM-Teams vom 2016er-Wettbewerb:
- Teams Aachen, Freiburg und München in unserer Dezember-Printausgabe (LJ 12/2016: 12-15).
- Team Hamburg im LJ online-Editorial vom 12.12.2016.