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Ultrahohe Affinitätschromatografie

(12.7.17) Hohe Ausbeute, Reinheit und Aktivität nach einem einzigen Reinigungsschritt - davon träumt so mancher Biologe, der sich mit der Reinigung vertrackter Proteinkomplexe oder störrischer Membranproteine abmüht. Die ultrahohe Affinitätschromatographie macht die Träume wahr.
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© Wikipedia

Früher oder später steht jeder vor der Aufgabe, sein Lieblingsprotein in einem entsprechenden Expressionssystem zu exprimieren, und es in möglichst reiner Form und hohen Mengen zu isolieren. Selten gibt es dafür rasche Lösungen. Jedes Protein verhält sich anders. Ein Protein-Tag für die Affinitätschromatographie, der bei einem Protein prima funktioniert, kann beim nächsten gänzlich versagen. Hinzu kommt, dass die Affinitätsreinigung über Säulen schnell an Kapazitätsgrenzen stößt - ein paar Moleküle des Wunschproteins fängt die Säule perfekt auf, der Großteil „rauscht“ aber einfach durch.

Die Affinitätsreinigung ist immer ein Balanceakt zwischen Reinheit und Ausbeute: Sind die Bedingungen beim Beladen der Säule und dem Waschen zu lax (geringe Salzkonzentration), bleiben auch viele unerwünschte Proteine an der Säule hängen. Sind sie zu stringent (zum Beispiel mehr als 0.5M NaCl) halten sie auch das Zielmolekül vom Binden an die Matrix ab. Es kann jedoch auch passieren, dass das gewünschte Protein in rauen Mengen an die Säule bindet, sich aber partout nicht mehr vom Matrixmaterial ablösen lässt (außer durch Kochen in SDS, wobei es „hops geht“). Wie in der Küche kommt es auf die richtige Salz-Dosis an. Und die ist bei jedem Gericht (Zielprotein) anders.

Es gibt ein gutes Dutzend standardmäßig verwendeter Affinitätschromatografie-Systeme, die alle nach dem gleichen Rezept funktionieren: Das Zielprotein wird zunächst als Fusionsprotein mit einem Tag exprimiert. Den Proteinextrakt trägt man auf die Chromatographie-Säule auf, die den Tag und somit auch das Zielprotein aus dem Extrakt heraus fischt. Je nach System wird das Zielprotein anschließend inklusive oder ohne Tag mittels pH-Shift, DTT-Zugabe, proteolytischem Verdau, et cetera eluiert. Seit Jahrzehnten rangiert im Affinitätschromatographie-Geschäft das His-Tag/Ni2+-Matrix-System auf Platz eins der Beliebtheitsskala. Gegenüber der ultrahohen Affinitätschromatografie, die Dmitry G. Vassylyevs Gruppe von der University of Alabama at Birmingham, USA entwickelte, wirkt es jedoch ziemlich archaisch (PNAS).

Vassylyevs Mitarbeiter haben ihre neues "Traumpaar" der Affinitätschromatographie von der Natur abgeschaut: Colicin-DNAsen (CE2, CE7, CE8, CE9) sind kleine, etwa 16kDa schwere hoch-toxische Proteine, die der dazugehörige spezifische Inhibitor, Immunity Protein (Im2, Im7, Im8, Im9) in Schach hält. CE/Im-Bindungen haben Dissoziationskonstanten (Kd) von 10-14 bis 10-17. Diese hohen Werte kommen den Dissoziationskonstanten kovalenter Bindungen sehr nahe und lassen bisherige Affinitätssysteme alt aussehen.

Dass die Bindestelle des Inhibitors - anders als in den meisten Enzym-Substrat-Assoziationen - abseits des aktiven Zentrums liegt, ist genauso außergewöhnlich wie nützlich. Das amerikanische Biochemiker-Team konstruierte aus CE7 die katalytisch inaktive Variante CL7, der die toxische DNAse-Aktivität und das DNA-Bindevermögen fehlen, deren hohe Affinität zu IM7 jedoch unbeeinträchtigt ist. CL7 dient als Protein-Tag, die Inhibitordomäne von Im7 ist über eine 26kDa-große „Immobilisierungseinheit", kovalent an Jodacetylagarose-Kügelchen gekoppelt.

Für die ultrahohe Affinitätschromatographie werden die Zellextrakte mit Im7-beladenen Agarosekügelchen inkubiert. Dank der hohen CL7/Im7-Affinität können Inkubation und Waschen unter sehr stringenten Bedingungen (mehr als 1M NaCl) erfolgen, was unspezifischen Möchtegern-Bindern ordentlich die Suppe versalzt. Zwischen Zielprotein und CL7-Tag liegt wahlweise eine SUMO-Domäne oder ein „Precision Protease Cleavage- Peptid“. Nach der Behandlung mit der jeweiligen Protease landet hierdurch das Tag-freie Protein im Eluat während der CL7-Tag an der Matrix verbleibt. Recyclen lassen sich die Agarosekügelchen direkt im Säulchen, und zwar hunderte Male. Dafür werden die CL7-Peptide mit 6N-Guanidinhydrochlorid abgelöst und die Im7-beladenen Agarosekügelchen in einem Renaturierungspuffer in ihren Ausgangszustand zurückgeführt.

Anhand einer bunten Sammlung von Zielproteinen demonstrierte das Team aus Alabama die Vorzüge der CL7/Im7-Technologie. Die Gruppe isolierte mit dem Verfahren Protein-Komplexe mit mehreren Untereinheiten, ein DNA-/RNA-Bindeprotein, ein Membranprotein sowie ein im nativen System gering exprimiertes Protein (Condensin-Komplex) aus Salmonella typhimurium. Die Ergebnisse verglich sie mit der klassischen His-Tag/Nickel-Aufreinigung.

Vassylyevs Ein-Schritt-Verfahren lieferte Proteine mit einer Reinheit von 92 bis 99 Prozent. Bei der His-Tag-Affinitätschromatogaphie lag diese bei lediglich 65 Prozent, weshalb oft ein zweiter chromatografischer Aufreinigungsschritt nötig ist. Egal ob N- oder C-terminal positioniert, der CL7-Tag erlaubt - zumindest für die gezeigten Kandidatenproteine - hohe Expressionsraten. Die Proteinaktivität bleibt hierbei intakt, was die Gruppe im Fall der gereinigten RNA-Polymerase aus Thermus thermophilus (ttRNAP) anhand eines Transkriptions-Elongations-Assays nachwies.

Laut Vassylyev und Co. ist der Produktivitätsfaktor, der aus dem Quotienten von gereinigter Proteinmenge und Reinigungszeit resultiert, 10 bis 500-mal höher als bei konventionellen Protokollen. So isolierte die Gruppe zum Beispiel aus sechs Gramm E. coli-Zellen binnen weniger Stunden etwa 20 Milligramm des humanen Calnexin-Proteins CNX, die einem Marktwert von 400.000 US-Dollar entsprachen. CNX gilt als vielversprechender Wirkstoff für die AIDS-Therapie. Einmal jährlich CNX oder ein ähnlich lukratives Protein reinigen und sich dann in Ruhe der eigentlichen Forschung widmen: Wäre das nicht eine attraktive Alternative zum aufwändigen und oft frustrierenden Fördermittel-Eintreiben?

Ob das CL7/Im7-System tatsächlich universell anwendbar ist und keine Haken hat, müssen Sie jedoch selbst herausfinden. Eine Bastelanleitung für die nötigen Expressionsvektoren und ein detailliertes Protokoll der ultrahohen Affinitätschromatographie finden Sie in den ergänzenden Informationen des Papers.

 

Andrea Pitzschke



Letzte Änderungen: 07.08.2017

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