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Doughnut-förmige Mikrogewebe aus Flüssigmurmel-Reaktor

(4.10.17) Umhüllt ein Doughnut-Bäcker seine Doughnuts mit Zuckerstreuseln, so trocknen sie langsamer aus und bleiben länger frisch. Eine zusätzliche Gelee-Füllung hält sie zudem von innen feucht. Dieses Prinzip funktioniert auch bei der 3D-Zellkultur.  
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© Nam-Trung Nguyen

Um bei Medikamentenscreenings, Krankheitsmodellierungen oder Wundheilungs-Assays aussagekräftige Ergebnisse zu liefern, sollten Zellen in einem möglichst realitätsnahen Zustand vorliegen. Zweidimensionale Zellkultur-Modelle sind hierfür alles andere als optimal, da Zellverbände in Wirklichkeit nicht flach dahinkriechen, sondern räumlich wachsen und rundherum Signale von Nachbarzellen empfangen - nicht nur seitlich.

Durch Zugabe von Gerüstsubstanzen (Scaffolds), wie zum Beispiel extrazellulärer Matrix, lassen sich Zellen zu dreidimensionalen Mikrogeweben heranzüchten.

Besser wäre es jedoch, ganz auf Scaffolds zu verzichten oder sie vollständig zu entfernen, sobald sie nicht mehr nötig sind. Ein Beispiel hierfür sind Sphäroide die man mit der Hanging Drop-Strategie erzeugt. In den kugelförmigen Mikrogeweben verdunstet jedoch das Nährmedium und die Konzentration der darin enthaltenen Substanzen steigt. Der austrocknende Gewebetropfen schrumpft hierdurch und stirbt innerhalb von Stunden ab.

Um die Verdunstung zu verhindern, entwickelte eine australische Gruppe einen Bioreaktor, der wie eine flüssige Murmel aufgebaut ist (Scientific Reports). Diese besteht aus einer kugelförmigen Zellsuspension, die von einem Schutzmantel umgeben ist. Innerhalb der Kugel können sich die Zellen frei bewegen, miteinander kommunizieren und aggregieren. Der Schutzmantel ist durchlässig und ermöglicht einen Luftaustausch. Da die Hülle die Verdunstung nicht ganz verhindert sondern nur verzögert, schützt ein zusätzliches Hydrogel im Inneren der Murmel die Zellen vor dem Austrocknen.

Die Herstellung des Flüssigmurmel-Bioreaktors ist nicht allzu kompliziert. Als Hydrogel dient 0.5 prozentige Agarose. Durch leichtes Rollen in hydrophobem Polytetrafluoroethylen (PTFE) Pulver werden einzelne Agarosetropfen zu Kugeln geformt und von dem PTFE umhüllt - ganz ähnlich wie ein Konditor kugelförmige Pralinen mit Streusel überzieht. Auf die abgelegte Agarosekugel mit einem Volumen von fünf Mikroliter gibt man einen Tropfen Zellsuspension mit dem doppelten Volumen. Der Tropfen läuft an den Seiten der Kugel herunter und benetzt diese. Die PTFE-Partikel wandern hierdurch automatisch von der Hülle der Agarosekugel an die Oberfläche der Zellsuspension die den Agarosekern umgibt. Damit diese flüssige Murmel von genügend PTFE-Partikeln umhüllt ist, wird sie nochmals in PTFE-Staub gerollt. Mit einer abgeschnittenen 1000µl-Pipettenspitze wird sie anschließend behutsam in die Mulde einer 96-Loch-Platte überführt und schließlich inkubiert. Die Volumina funktionstüchtiger Murmel-Reaktoren reichen von zwei bis fünfzig Mikroliter. Die Australier verwendeten für ihre Optimierungsexperimente aber durchgehend Murmeln mit zehn Mikroliter Volumen.

Fehlt der Hydrogel-Kern, verschrumpeln die Murmeln innerhalb von 24 Stunden. Die Zellen mögen weder einen zu hohen (2 Prozent) noch einen zu niedrigen (0.25 Prozent) Agaroseanteil, da so der Bioreaktor von innen „gesprengt“ beziehungsweise ungenügend stabilisiert wird. Die ursprüngliche Zelldichte muss so eingestellt sein, dass sich die Zellen gleichmäßig verteilen. Zu hohe oder zu niedrige Konzentrationen führen zu Verklumpung oder Vereinsamung und damit zum Tod.

Die Zellen gehorchen der Gravitation und setzen sich hauptsächlich an der Unterseite des Agarosekerns auf dem Boden der Mikrotiterplatte ab. Damit sie zu Mikrogewebe und nicht nur zu einzelnen Grüppchen heranwachsen, brauchen sie einen Dirigenten. Dieser sitzt im Kern der Agarosekugel. In ihm wird vorab eine Locksubstanz untergebracht. Hierzu wird ein Wachstumsfaktor in niedrig schmelzende Agarose (37 °C) gemischt, die anschließend zu Kugeln geformt wird.

Die Zellen nehmen den Wachstumsfaktor wahr der diffusionsbedingt allmählich nach außen wandert, und hierdurch einen Konzentrationsgradienten aufbaut. Aufgrund von Gravitation, Zell-Zell-Kohäsion und Chemotaxis formieren sich die Zellen zu einem Ring, der durch das Selbstorganisations-Vermögen der Zellen, binnen zwölf Stunden zu einem Doughnut-förmigen Mikrogewebe heranwächst. Der Außendurchmesser des Gewebes wird durch das Volumen von Bioreaktor und Agarosekern vorgegeben. Der Doughnut-Innendurchmesser hängt von der Wandergeschwindigkeit der Zellen ab. Ist die anfängliche Zelldichte hoch, führt dies zu schnellerem Wachstum und pralleren Doughnuts. Mit 5000 Zellen pro Mikroliter wird das Gebilde so prall und rundlich, dass es eher einem Berliner (dem Fettgebäck, nicht dem Hauptstadtbewohner) ähnelt. In empirischen Tests ermittelte die Gruppe die Idealmaße vitaler Doughnuts (Oberfläche/Volumenverhältnis) sowie die Anfangszelldichte (2000 Zellen/µl), um diese zu erreichen. Ein mathematisches Modell liefern sie gleich mit. Dieses gilt jedoch nur für den von ihnen verwendeten Zell- und Wachstumsfaktortyp.

Der Agarosekern ist also ein Multitalent. Einerseits sorgt er für das richtige Wachstumsklima und schützt die Zellen vor der Austrocknung. Andererseits dient er als Quelle aus der kontinuierlich ein Wirkstoff in den Reaktor diffundiert. Der Clou ist jedoch, dass er nach getaner Arbeit entfernt werden kann. Pikst man die flüssige Murmel an, so läuft das überschüssige Zellmedium aus und der Agarosekern flutscht aus dem Doughnut-förmigen Mikrogewebe heraus. Dieses kann dann zum Beispiel für Medikamentenscreenings verwendet werden.

 

Andrea Pitzschke



Letzte Änderungen: 26.10.2017

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