Wo Fehler in der Produktion, Verteilung oder dem Abbau von lncRNAs auftreten, kommt es zu vielerlei Krankheiten, allen voran Krebs. Der Grund hierfür ist die Kontrollfunktion von lncRNAs bei der Expression von Genen. Sie heften sich an Transkriptionsfaktoren und manipulieren deren Aktivität und/oder Lokalisation. Wüsste man, welcher Transkriptionsfaktor welcher lncRNA gehorcht, ließen sich Therapien gezielter entwickeln.
Die bisherige Herangehensweise dazu war die Immunopräzipitation der anvisierten lncRNA (lncRNA-IP) nebst anhaftenden Proteinen, und die Identifikation der Anhängsel mithilfe der Massenspektrometrie (MS). Im Gegensatz zur verwandten Chromatin-Immunopräzipitation sind bei der lncRNA-IP jedoch zusätzliche Hürden zu überwinden: lncRNAs sind, wie alle Transkripte, anfällig für den Abbau und zudem ziemlich seltene Spezies. Auch die von ihnen kontrollierten Transkriptionsfaktoren zählen nicht gerade zur zellulären Massenware.
Um diese Raritäten in der Zelle zu finden, musste bisher der Einsatz an Startmaterial (Zellen) entsprechend hoch sein. Und was an Protein-Eluat am Ende herauskam, war häufig zu dünn für eine MS-Messung. Wie kriegt man die Ziel-lncRNAs und ihre Interaktionspartner, überhaupt zu fassen? Das geht zum Beispiel mit biotinylierten antisense-DNA-Oligos. Während der Biotinyl-Tag der Immobilisierung an Matrixmaterial dient, finden die antisense-Oligos ihre komplementären RNA-Moleküle. Crosslinking sorgt dafür, dass Proteine, die an den lncRNAs anhaften, nicht verloren gehen.
Vor der Analyse von 100 bis 800 Millionen Zellen, die pro IP nötig sind, schrecken viele mangels Zeit, Kapazität und Budget jedoch zurück. Eine Gruppe um den lncRNA-Spezialisten Carl Novina vom Dana-Farber Cancer Institute, in Boston hat die Hemmschwelle für lncRNA-IPs, mit einem sogenannten RNA-Associated Transcription Factor Array (RATA) jedoch deutlich gesenkt. Welche Tricks sie für RATA verwenden, beschreibt Novinas Team in einem detaillierten Methodenpaper das sämtliche Schritte des Protokolls ausführlich erklärt (J Biol Methods).
Als Forschungsobjekt verwendeten die Amerikaner Melanomzellen, prinzipiell sollte das Verfahren aber auch mit anderen Säugerzellen funktionieren. Die Zellen werden transient mit zwei Plasmiden kotransfiziert. Davon kodiert eines für das MS2-Protein und ist mit Kernlokalisationssignal und FLAG-Tag ausgestattet. Das zweite trägt die gewünschte lncRNA-Sequenz sowie ein Dutzend Kopien von MS2-RNA-Aptameren (5´oder 3´möglich).
Die Idee die hinter RATA steckt ist nicht ganz neu: MS2 ist ein Bakteriophagen-Hüllprotein, das sich mit hoher Affinität an spezielle RNA Stem-Loop-Strukturen haftet. Eben diese Stem-Loop-Strukturen finden sich in den MS2-RNA-Aptameren. Zur Immunopräzipitation benötigt man einen anti-FLAG-Antikörper. Der fischt das MS2-Protein aus dem Zellextrakt und immobilisiert es indirekt an einer Matrix (Protein G-beads). An das so exponierte und konzentrierte MS2-Protein können jetzt die Aptamere, mit ihrer lncRNA im Schlepptau, binden. Was auch immer sonst noch an der lncRNA baumelt (das heißt echte Proteinpartner), wird automatisch mit immobilisiert.
Von der Matrix ablösen lassen sich diese Proteinpartner durch Inkubation mit dem FLAG-Peptid - und zwar im nativen Zustand. Das FLAG-Peptid verdrängt jegliche Konkurrenz von den Antikörper-Bindestellen. Im Eluat landet der gesamte Komplex aus MS2-FLAG, MS2-Aptamer, lncRNA sowie anhaftenden Proteinen.
Welche Transkriptionsfaktoren sich hinter den Proteinen verbergen, wird im Anschluss mit einem kommerziellen Transkriptionsfaktoraktivitäts-Array analysiert. Dieser gibt Auskunft über das Leistungsvermögen und die Promoter-Motiv Präferenz der getesteten Kandidaten. Wichtig ist hier, eine Kontrollprobe mitzuführen, die von Zellen stammt, welche ungetaggte RNA (ohne Aptamer) exprimieren. So lässt sich zwischen tatsächlichen lncRNA-Interaktionspartnern und sonstigen Transkriptionsfaktoren unterscheiden.
Das ganze funktioniert im 96-Well-Format und erfordert lediglich einen Plattenleser. Für den Aktivitäts-/Identitäts-Assay werden Kandiatenproteine (direkt in Form des Eluats) mit Biotin-gelabelten DNA-Sonden inkubiert. Deren Sequenzen stehen für bekannte Konsensus-Motive ausgesuchter Transkriptionsfaktoren. Über Säulchen lassen sich die formierten Komplexe (aus Kandidatenprotein und biotinmarkierter Sondensequenz) von den restlichen Proteinen trennen.
Das Eluat überführt man in vorbereitete 96-Well-Platten, in deren Löchern ein jeweils anderes DNA-Motiv haftet. Ist die DNA-Sequenz zu einer der Biotin-markierten Sonden des Eluats komplementär, kommt es im entsprechenden Loch zur Hybridisierung. Durch Zugabe von Merrettich-Peroxidase-konjugiertem Streptavidin lassen sich die Wechselwirkungen detektieren. Die erhaltenen Signale gestatten eine zumindest semi-quantitative Aussage über die transkriptionelle Aktivität des Kandidatenproteins.
RATA beschränkt sich nicht nur auf die Suche von lncRNA-Interaktionspartnern. Die Technik sollte auch für sonstige ncRNAs funktionieren. Wer das Kernlokalisationssignal am MS2-Protein weglässt oder ersetzt kann auch nach Interaktionspartnern im Cytosol oder anderen Kompartimenten fischen. Wichtig ist, sowohl die Plasmidkonzentration als auch die Expressionsdauer (Erntezeitpunkt) an das eigene Experimentsystem anzupassen. Die Autoren schlagen zudem Kontrollen an mehreren Protokollschritten vor, zum Beispiel durch Western Blots.