(14.02.2018) Phagen sind eine äußerst effektive und vor allem spezifische Waffe im Kampf gegen Krankheitserreger: Sie befallen nur ihren Lieblings-Bakterienstamm - das übrige Mikrobiom im menschlichen Körper interessiert sie nicht. Leider haben sie auch einige Schwachpunkte. So existiert zum Beispiel für die wenigsten Erreger ein passender Phage. Darüber hinaus haben Bakterien etliche Strategien entwickelt, Phagen zu bändigen oder ihnen den Zutritt zu verwehren. Und zu guter Letzt treten Phagen teilweise als "gemäßigte", temperente Phagen in einen Schlummermodus ein, der keine Zelllyse auslöst.
Die Entwicklung von Phagen zu potenten Biowaffen wurde auch dadurch gebremst, dass sie sich genetischen Manipulationen oft erfolgreich widersetzen. Die homologe Rekombination ihrer DNA verlangt aufwändige Screenings; multiple Änderungen im Genom sind nur schrittweise möglich. Zudem müssen Phagen, die als Bakterienkiller wirken sollen, virulent sein. Temperente Phagen, die zwischen lytischem und lysogenen Zustand wechseln, fehlt die nötige Durchschlagskraft. Im lysogenen Zustand integrieren sie ihre DNA einfach in das Genom des Wirtsbakteriums. Dies garantiert zwar eine Vermehrung mit jeder Teilung der Wirtszelle, die Zelllyse bleibt aber aus.
Eine neue Technik, die die Gruppe des Lebensmittelmikrobiologen Martin Loessner von der ETH Zürich entwickelte, löst einige dieser Probleme. Mit ihr kann man maßgeschneiderte Phagen gegen unterschiedliche Bakterien herstellen und das Phagengenom "rebooten", um temperente Phagen in virulente umzuprogrammieren. Als Plattform für das Rebooten dient das Bakterium Listeria monocytogenes.
Die Forscher schleusten zunächst die DNA des virulenten Listerien-Phagen P35 in L-Form-Listerien ohne Zellwände ein (Rev2L), um die Bedingungen für die Phagenproduktion zu optimieren und die Schlagkraft der entstandenen Phagen anhand eines Indikator-Bakterienstamms zu messen. Die mehr als 30.000 kb große Phagen-DNA übertrugen die Forscher mit Hilfe von PEG-8000 in die Rev2L-Zellen. Um zu verhindern, dass die zellwandlosen L. monocytogenes-Zellen platzten oder schrumpften, passten Loessners Mitarbeiter das Medium osmotisch an.
Die P35-DNA wurde von den Rev2L-Zellen aufgenommen und führte zum Rebooten des Phagen Genoms: Die Virus-Gene wurden exprimiert und zu einem Virus zusammengebaut. Anschließend setzten die Forscher die vermehrten Phagen frei, indem sie Rev2L-Zellen in osmotisch nicht-stabilisiertes Medium überführten. Danach vermengten sie die Phagen mit dem Indikatorstamm, der lysiert und getötet werden sollte, und beobachteten die hierdurch entstandenen Plaques in Soft-Agar-Overlay-Tests.
Nach der Optimierung der Kulturbedingungen mit verschiedenen Listerien-Phagen, wollten die Forscher wissen, ob das Rebooten in Rev2L-Zellen auch bei Phagen funktioniert, die andere Gram-positive Bakterien befallen. Hierfür transfizierten sie Rev2L mit der DNA diverser virulenter und temperenter Phagen. Anschließend infizierten sie entsprechende Indikatorstämme mit den hieraus resultierenden Phagen. Auch hier bildeten sich Plaques. Das Team um Loessner schloss daraus, dass L. monocytogenes ein universeller Zwischenwirt ist, der sich für das Rebooten unterschiedlicher Phagen-DNA eignet.
Die L-Form von Listeria monocytogenes ist wenig wählerisch bezüglich Morphologie, Genstruktur, DNA-Verpackungsform, Replikationsstrategie und Genomgröße der aufgenommenen Phagen-DNA. Letztere kann sogar rein synthetisch sein. Wenn man die Sequenz einer Phagen-DNA kennt, die zur Lyse eines Bakterienstamms führt, lässt sich diese auch in vitro zusammenbauen. Etwa mit sechs circa 6kb-großen Fragmenten, die mit überlappenden Enden versehen und per PCR amplifiziert werden.
Je nach Bakterienstamm, den die Phagen töten sollen, benötigt man zusätzliche Phagenfunktionen oder muss unnötige beseitigen. Loessners Gruppe "bewaffnete" die Phagen zum Beispiel mit Endolysin indem sie das entsprechende Gen in das Phagen-Genom einbaute. Die aufgerüsteten Phagen bezwangen auch die dicken Mauern Gram-positiver Bakterien. In einem weiteren Experiment entfernten die Forscher die sogenannte Lysogeny Control Region (LCR), die häufig als Cluster in der Phagen-DNA auftritt. Ohne die LCR konnten die Phagen nicht in den lysogenen Zustand wechseln - sie waren durchgehend virulent.
Mit der Reboot-Plattform ist es auch möglich, maßgeschneiderte Phagen zu erzeugen. So konstruierten die Forscher mit ihr zum Beispiel Phagen, die Staphylococcus aureus oder Bacillus cereus eliminierten. Die Zerstörung der Bakterien funktionierte nicht nur in Overlay-Agar-Tests, sondern auch in Flüssigkulturen. Es genügte sogar, wenn nur ein Bruchteil der Phagen Endolysine exprimierte: Die Enzyme öffneten auch Phagen die Pforten in die Bakterien, die keine Endolysine bildeten.
Die neue Technik lässt sich aber nicht nur verwenden um Bakterien zu töten. Prinzipiell sollte es mit ihr möglich sein, Phagen mit therapeutischen Genen auszustatten und sie an den Zielort, zum Beispiel die Mikrobiota des Darms, zu bringen. Die Methode ließe sich auch mit einer fehleranfälligen PCR erweitern, um die Funktion von Phagenproteinen durch künstliche Evolution zu optimieren.
Andrea Pitzschke