Gießener Mikrobiologen um Gabriele Klug beschreiben, wie ein Cryptochrom die Expression von Photosynthesegenen steuert.
(19. November 2012) Wenn Gabriele Klug von ihren Untersuchungsobjekten spricht, entsteht schnell der Eindruck, es handele sich um Menschen. Doch der Hauptdarsteller in ihrer neuesten Veröffentlichung heißt Rhodobacter sphaeroides. „Man könnte meinen, der ist ganz schön dumm. Er versucht nämlich, im Dunkeln Photosynthese zu betreiben und bildet einen Photosyntheseapparat“, beschreibt die Gießener Mikrobiologin das Bakterium. „Aber erstens ist es irgendwie verständlich, alle Möglichkeiten auszuprobieren, wenn keine anderen Nahrungsquellen verfügbar sind, und zweitens lebt er ja normalerweise nicht in meinem Reagenzglas im dunklen Labor, sondern im Teich – und da geht die Sonne irgendwann wieder auf. Dafür ist er dann gewappnet.“
Das Bakterium ist fürwahr anpassungsfähig: Es kann sowohl aerob als auch anaerob atmen, betreibt anoxygene Photosynthese und kann sogar gären. Die Entscheidung „Photosynthese oder nicht?“ hängt bei R. sphaeroides im Wesentlichen von zwei Faktoren ab: Der Lichtmenge und dem Sauerstoffpartial-druck. Hat das Bakterium viel Sauerstoff zur Verfügung, betreibt es aerobe Atmung und synthetisiert keine Photosynthese-Komplexe. Sinkt der Sauerstoffpartialdruck, werden Gene für die Synthese von Pigmenten und Lichtsammelkomplexen exprimiert und Photosynthese kann stattfinden – allerdings nur, wenn die Bakterien keinem Licht ausgesetzt sind.
Fakultativ anaerob
Rhodobacter bildet im Dunkeln also einen Photosyntheseapparat, den es nutzen kann, sobald die Bedingungen günstig sind, wenn also wenig oder kein Sauerstoff, dafür aber Licht vorhanden ist. Befindet es sich in einer Umgebung, in der sowohl Sauerstoff als auch Licht vorhanden sind, werden die Photosynthesegene hingegen reprimiert. So vermeidet das Bakterium vermutlich die Bildung von schädlichem Singulett-Sauerstoff. Unter anaeroben oder mikroaeroben Bedingungen dagegen resultiert Licht nicht in Genrepression. Dann werden Gene für Pigmentsynthese und Pigmentbindeproteine induziert, Photosynthese-Komplexe gebildet und anoxygene Photosynthese kann stattfinden.
Die Regulationsmechanismen, die diese Prozesse steuern, hat die Arbeitsgruppe um Klug genauer unter die Lupe genommen. „Wir kennen viele bakterielle Photorezeptoren, aber die Signalmechanismen sind weitgehend unverstanden“, erzählt die Forscherin. Besonders zwei Proteine haben es den Forschern aufgrund ihrer ungewöhnlichen Eigenschaften angetan: Cryptochrom CryB und das Protein AppA fungieren als Blaulicht-Photorezeptoren und gleichzeitig – und das ist das außergewöhnliche an ihnen – als Redoxsensoren.
Bei AppA wusste man schon länger um die Doppelrolle. „AppA war der erste Photorezeptor, den man gefunden hat, der eine zusätzliche redoxsensitive Domäne besitzt“, erzählt Klug. Das Protein wurde ursprünglich als Redox-Regulator von Photosynthesegenen identifiziert, der als Antagonist zum transkriptionellen Repressor PpsR fungiert. Außerdem besitzt AppA am N-Terminus eine sogenannte BLUF (Blue light sensing using FAD)-Domäne, die für die Photorezeptoreigenschaften verantwortlich ist. Bei mittleren Sauerstoffkonzentrationen und Bestrahlung mit blauem Licht verhindert diese Domäne die Bindung an PpsR. Die C-terminale Domäne „SCHIC“ (Sensor containing heme instead of cobalamin) bindet Häm und ist redoxsensitiv.
Hefehybriden bringen‘s ans Licht
Wie das Team zeigen konnte, ist auch Cryptochrom CryB gleichzeitig licht- und redoxsensitiv (Nucleic Acids Res 2012, 40(13):5901-9). Erst kürzlich haben Marburger Strukturbiologen um Lars-Oliver Essen in Kooperation mit den Gießenern die Struktur des Proteins dargestellt und einen Eisen-Schwefel-Komplex identifiziert, der vermutlich für die Redoxsensitivität verantwortlich ist (EMBO Rep 2012, 13(3):223-9).
Bereits in früheren Arbeiten hatten die Gießener Mikrobiologen herausgefunden, dass CryB die Expression der Photosynthesegene beeinflusst. Über den zugrundeliegenden Mechanismus war bis dato jedoch kaum etwas bekannt. Da das Protein nur schlecht an Doppelstrang-DNA bindet, vermuteten die Forscher, dass die Regulation über Interaktion mit anderen Proteinen erfolgt. In Interaktionsstudien in einem sogenannten Hefe-Zwei-Hybrid-System konnte gezeigt werden, dass sich die Wechselwirkung von AppA und CryB in verringerter β-Galactosidaseaktivität der entsprechenden Hefezellen widerspiegelt. Die Forscher verglichen die β-Galactosidaseaktivität von Hefezellen, die sowohl das cryB-Gen als auch das appA-Gen trugen, mit jener von Zellen, die als positive Kontrolle zwei stark interagiernde Proteine exprimieren. Und tatsächlich, die Doppelhybridzellen zeigten nur etwa 40 Prozent der Enzymaktivität der Kontrollansätze.
Licht und Luft
Selektive Anzucht von Hefezellen, die verschiedene AppA-Domänen trugen, ließ außerdem darauf schließen, dass CryB spezifisch mit der SCHIC-Domäne und dem C-terminalen Ende, also dem Redox-sensitiven Abschnitt des AppA-Proteins inter-agiert. In „Pulldown“-Versuchen bestätigten die Forscher die Beobachtungen in vitro: Wurde rekombinantes AppA-Protein an eine Affinitätssäule gekoppelt und zell-freier Rhodobacter-Extrakt über die Säule gegeben, konnte die Bindung von CryB an AppA nachgewiesen werden. CryB war nur dann im Western Blot sichtbar, wenn es zuvor an die entsprechenden markierten AppA-Domänen binden konnte.
Ähnliche Resultate erhielten die Wissenschaftler mit AppA-Abschnitten, denen der N-Terminus fehlte oder Abschnitten, die nur die SCHIC-Domäne trugen. In vivo konnten die Mikrobiologen zeigen, dass die Interaktion der beiden Proteine lichtabhängig ist: Hefezellen, die appA und cryB in den entsprechenden Plasmiden des Zwei-Hybrid-Systems trugen, und unter blauem Licht inkubiert worden waren, zeigten fast doppelt so hohe β-Galactosidaseaktivität wie die im Dunkeln gehaltenen Kontrollkulturen.
Cryptochrom CryB und AppA steuern also gemeinsam die Expression von Photosynthesegenen: AppA kontrolliert deren Expression durch Interaktion mit dem transkriptionellen Repressor PpsR. PpsR wiederum reprimiert die Photosynthesegene bei hohen Sauerstoffpartialdrücken, indem er an die Zielpromotoren der puf- und puc-Gene bindet, die beide für die Synthese von Pigmentbindeproteinen notwendig sind.
Bereits 2007 zeigten Gabriele Klug und Kollegen, dass der C-Terminus von AppA die Bindung von PpsR an den puc-Promotor verhindert (Mol Microbiol 2007, 64(4):1090-104). Die puc-Gene codieren Proteine des Lichtsammelkomplexes. Ein Gelretardationsversuch zeigte den Forschern, wie CryB die Interaktion von AppA und PpsR beeinflusst. Unter oxidierenden Bedingungen genügen bereits geringe Mengen PpsR, um an den puc-Promotor zu binden und die DNA-Fragmente im Gel zu verlangsamen – allerdings nur dann, wenn kein Überschuss an AppA vorlag. Mit steigender Konzentration des AppA-Proteins wird mehr PpsR durch AppA gebunden: Die nun freigewordenen DNA-Fragmente wandern ungebremst durch das Gel. CryB hat keinen Einfluss auf diesen Prozess. Anders sieht es unter reduzierenden Bedingungen aus: Durch die Interaktion mit der C-terminalen Domäne von AppA inhibiert CryB dessen Bindung an PpsR. Der transkriptionelle Repressor wird dadurch frei und kann an die DNA binden.
„In Prokaryonten haben Cryptochrome normalerweise keine so offensichtlichen physiologischen Effekte wie in Rhodobacter“, erklärt Gabriele Klug die Besonderheit ihrer Entdeckung. „Den Einfluss von CryB sieht man dagegen direkt in einer veränderten Pigmentierung. Außerdem wirken mit AppA und CryB gleich zwei Photorezeptor-Proteine auf die Signalkette, was ebenfalls ungewöhnlich ist.“
Multitasking-Repressor
Photorezeptoren und bakterielle Phototrophie sind nur ein Teil der Gießener Projekte. „Wir beschäftigen uns intensiv mit RNA-Prozessierung und Degradation in Bakterien und Archaeen sowie der Regulation von Stressantworten in Rhodobacter, wobei in den letzten Jahren die Rolle von nicht-kodierenden, regulatorischen RNAs in den Vordergrund getreten ist.“
Dennoch – die Untersuchung von licht- und sauerstoffabhängiger Genregulation in Rhodobacter begleitet Gabriele Klug schon seit ihrer Promotion. „Ich war damals noch in Freiburg und mein damaliger Professor, Gerhart Drews, hat sich sehr für das Themengebiet interessiert. Es gab aber wenig molekularbiologisches Know-how in der Gruppe und so mussten die Doktoranden viele Methoden selbst etablieren. Als ich nach meiner Promotion nach Stanford gegangen bin, habe ich die Prozessierung der mRNA der Photosynthesegene untersucht, die eine wichtige Rolle in der Regulation ihrer Expression spielt.“
Die Forscherin will sich auch weiterhin mit dem außergewöhnlichen Cryptochrom beschäftigen. „Wir wollen CryB physiologisch genauer untersuchen und nachsehen, welche Co-Faktoren in welchen Signalwegen eine Rolle spielen und welche Mechanismen in vivo ablaufen. Wir wissen bereits, dass das Cryptochrom auch Gene steuert, die nicht zum PpsR-Regulon gehören. Neben puf und puc gehören auch Gene, die für die Synthese von Carotinoiden oder Bakterienchlorophyll verantwortlich sind, zu dem transkriptionellen Repressor. Sie befinden sich gruppiert auf dem Chromosom. Gene, die für die Synthese von Häm oder von bestimmten Enzymen verantwortlich sind, liegen in anderen Regionen des Chromosoms, sind aber offenbar trotzdem abhängig von cryB. Wir wissen aber noch nicht, wie die Steuerung hier abläuft.“
Andrea Perino
(Der Artikel erschien in der aktuellen Laborjournal-Ausgabe 11/2012 auf den Seiten 46-47)