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uDISCO (Tissue Clearing)

von Karin Hollricher (Laborjournal-Ausgabe 10, 2016)


Stichwort

Fluoreszenz-markierte Maus, nachdem das gesamte Gewebe durch uDISCO-Behandlung transparent gemacht wurde. Foto: Ali Ertürk

Party? Tanzen? Eher nicht. Hier geht’s nicht um die Dancing Queen, oder das Material Girl mit Saturday Night Fever. Nein, wir müssen viel weiter in der Geschichte zurückgehen – mehr als hundert Jahre. Bei uDISCO geht es nämlich ums Mikroskopieren.

1902 beschrieben der Physiker Henry Siedentopf und der Chemiker Richard Zsigmondy in Annual Physics eine Methode, die sie Ultramikroskopie nannten. Diese Mikroskopietechnik war so hoch auflösend, dass die beiden damit kolloidartige Partikel von weniger als 4 Nanometer Durchmesser abbilden konnten. Dies gelang, indem sie ihre Proben nicht von oben oder unten beleuchteten, sondern von der Seite – wodurch sie sehr hohe Schärfe und Tiefenschärfe erreichten.

Für damalige Verhältnisse war das so brillant, dass Zsigmondy 1925 den Chemienobelpreis erhielt. Der Ruhm hielt jedoch nicht lange, die Ultramikroskopie geriet über neue Erfindungen erstmal wieder in Vergessenheit. Aber sie wurde wieder entdeckt. Erste Beschreibungen stammen aus den frühen 1990er Jahren, der „Durchbruch“ kam schließlich Anfang des Jahrtausends. Na, dämmert was? Richtig, wir sprechen hier von der Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM) oder Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM).

Scheibenschneiden ade

Diese Technik machten sich kürzlich Ali Ertürk und seine Kollegen von der Ludwig-Maximilians-Universität in München zunutze, um Mäuse vollständig abzubilden. Für gewöhnlich würde man die Mäuse in dünne Scheiben schnippeln, diese einzeln abbilden und das Ganze per Software zu einem dreidimensionalen Modell zusammensetzen. Die Münchner entwickelten jedoch ein Verfahren, intakte Mäuse zu mikroskopieren; aber Staying Alive war für die Tiere dabei dennoch nicht drin.

Für die Light Sheet Mikroskopie braucht man auf jeden Fall intakte Fluoreszenzmoleküle. Und für eine Ganzkörper-Mikroskopie sollte man die Tiere schrumpfen sowie außerdem das Wasser, welches das Licht stark streut und somit für die Mikroskopie wenig geeignet ist, ersetzen. Weiterhin muss man Gewebe, Knochen und Organe möglichst gut entfetten (anti-Grease). Denn: Ziel ist ein möglichst transparentes Tier. Protokolle zu solchem „Tissue Clearing“ findet man schon in hundert Jahre alten Wissenschaftsschmökern, aber auch in der jüngsten Literatur – die Verfahren heißen dann etwa DUBIC, LUMOS, Scale und SeeDB (Reviews in Nature Methods 11: 1209-14 sowie Cell 162: 246-57).

Wasser ersetzen, Fett entfernen

Die Münchner selbst hatten zuvor eine Mixtur namens 3DISCO entwickelt (Nature Protocols 7: 1983-95). Aber darin ging das GFP leider sehr schnell kaputt. Also experimentierten sie weiter mit Lösungsmitteln. Zum Dehydrieren verwendeten sie tert-Butylalkohol, als guten Wasser-Ersatz identifizierten sie eine Mischung aus Diphenylether (DPE), Benzylalkohol und Benzylbenzoat. Die letzten beiden Substanzen sind nötig, um das bei Raumtemperatur feste DPE zu verflüssigen.

Axone als Proof-of-Principle

DPE wählten sie, weil es einen Brechungsindex von 1,579 hat, der nahe demjenigen von entfettetem und dehydriertem Gewebe liegt. Warum das wichtig ist? In ganz einfachen Worten: damit das Licht lateral möglichst wenig gestreut wird, so dass es gleichmäßig durch die Probe hindurch geht. Je tiefer man in die Probe schauen will, desto wichtiger ist dieser Punkt.

Ihre bestimmt wenig geruchsneutrale Mischung nannten sie – etwas phantasielos – BABB-D. Eine Behandlung mit BABB-D entfernt das Fett selbst aus lipidreichen Geweben wie Hirn und Knochenmark. Es macht Gewebe transparent – sogar stark mineralisierte Knochen. Und GFP bleibt darin über mehrere Wochen stabil und anregbar. That’s the way: Ende August publizierten Ertürk und Mitarbeiter uDISCO (= ultimative 3D Imaging of Solvent-Cleared Organs) in Nature Methods (doi 10.1038/NMETH.3964).

Als Proof-of-Principle mikroskopierten die Forscher das neuronale Netzwerk transgener Thy1-YFP-Mäuse – vom Kopf bis zum kleinen Zeh. Thy1 (CD90) dient dabei als neuronaler Marker. So erreichten Ertürk et al. eine laterale Auflösung von 0.5 bis 2 Mikrometer und eine axiale Auflösung von etwa 4 Mikrometer. Nicht so gut wie Zsigmondy, aber ausreichend gut, um Neuronen abzubilden, deren Axone in Säugetieren zwischen 0,08 und 20 Mikrometer dick sind. Auch injizierte Stammzellen konnten sie lokalisieren.

Nun wollen die Münchner ihr Verfahren zur Analyse neuronaler Erkrankungen verwenden und erhoffen sich daraus neue Erkenntnisse für die Medizin. Mehr als Dreamer?



Letzte Änderungen: 12.10.2016


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