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Proteinsequenzierung mit Nano-Elelektrospray Massenspektrometrie

von Ralf Neumann (Laborjournal-Ausgabe 06, 1996)


Des Forschers Rechnung ist einfach: Je empfindlicher, zuverlässiger und schneller eine Methode, desto mehr kommt pro Zeiteinheit raus. Bestes Beispiel aus der DNA-Methodik ist die PCR. Doch auch die Proteinchemiker brauchen immer weniger ihrer Lieblingsmoleküle für ihre Analysen. Ein paar Hundert Femtomole genügen der Nano-Elektrospray Tandem-Massenspektroskopie (Nano ES-MS/MS), um eindeutige Aminosäure-Sequenzmotive zu ermitteln.

Athleten wissen es von der Dopingkontrolle: Kleine biochemische Moleküle trennt und identifiziert der Chemiker am liebsten mittels Massenspektroskopie. Er verdampft die vorbehandelte Probe durch Erhitzen und ionisiert die flüchtigen Moleküle durch Elektronen-Bombardement im Vakuum. Da nun jedes der Moleküle ein charakteristisches Verhältnis zwischen Masse und Ladung besitzt, fliegen sie im nachfolgenden elektrischen Feld auf verschiedenen Bahnen und werden schön sauber aufgetrennt. Und wehe, der Kontolleur findet ein verbotenes Steroid.

Proteine jedoch zerfielen regelmäßig bei so roher Behandlung, bis fleißige Tüftler die Elektrospray (ES)-Technik als schonende Alternative präsentierten: Die Proteinlösung wird hierbei durch eine feine Nadel gedrückt, die unter hohem elektrischem Potential steht. Dadurch zerstäubt die Lösung in kleinste hochgeladene Tröpfchen, die schnell verdampfen und "nackte", protonierte Proteinmoleküle direkt in die Vakuumkammer des Massenspektrometers entlassen.

Kritisch für die Qualität der so erhaltenen Spektren ist allein die Konzentration der Proteinlösung, nicht die Durchflußgeschwindigkeit. Daher entwickelten Matthias Mann und seine Mitarbeiter am EMBL in Heidelberg eine Nano-Elektrospray-Vorrichtung, mit der sie 1 µl Lösung über 30 Minuten hinweg versprühen können und konstant auswertbare Signale erhalten. Der Analyse kleinster Proteinmengen war damit die Tür geöffnet - insbesondere dem Sequenzieren mittels Nano-ES-MS/MS-. Ein erstes Massenspektrometer isoliert das gewünschte Protein aus dem Gemisch. Danach bricht es der Beschuß mit schnellen Gasatomen in einzelne Trümmer, die abschließend im zweiten Spektrometer getrennt werden.

Die Auswertung der Spektren ist allerdings nicht leicht. Spezielle Algorithmen errechnen jedoch zuverlässig Sequenzabschnitte von bis zu 15 Aminosäuren. In der Regel reicht das, um in großen Sequenz-Datenbanken die vollständige Sequenz zu finden, falls das Protein oder das entsprechende Gen erfaßt ist. Oder man kloniert das Gen direkt über abgeleitete Oligonukleotide mittels PCR.

Zweimal haben Matthias Mann und Co. letzteres schon geschafft. Zuerst sequenzierten und klonierten sie einen Teilungsinhibitor des kapillaren Endothels - ein Protein also, welches die Entstehung neuer Blutgefäße in soliden Tumoren hemmen könnte. 5 ng Inhibitorbande, direkt aus dem silbergefärbten Gel geschnitten, reichen dafür aus. Gleiches gelang ihnen vor kurzem mit der Apoptose-Signalprotease FLICE, die direkt durch Besetzung des "Todes-Rezeptors" APO-1 aktiviert wird. 500 Femtomol FLICE im Gel waren genug.



Letzte Änderungen: 19.10.2004


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