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Jetzt mal ehrlich

Revolutionäre Lichtscheibe

von Ernst H. K. Stelzer, Frankfurt


Die Lichtscheiben-Mikroskopie senkt die Strahlenbelastung der beobachteten Zellen und eröffnet neue Einblicke in das dreidimensionale ­Zellgeschehen.

Das Leben beruht auf dreidimensionalen, zeitabhängigen Prozessen. So wachsen zum Beispiel die Zellen des Menschen nicht auf harten und flachen Oberflächen sondern auf anderen Zellen. Sie sind in ein Gewebe eingebunden, in dem sie mit vielen weiteren Zellen interagieren. Wenn wir das Leben studieren wollen, ist es sinnvoll zu beobachten, wie der gegenseitige Austausch der Zellen funktioniert und wie sich Zell-Zell-Interaktionen entwickeln. Leider streut und absorbiert organisches Gewebe das Licht sehr stark, so dass es kaum möglich ist, große, dreidimensionale und vielzellige Objekte in einem konventionellen Fluoreszenzmikroskop zu beobachten.

Daher sollten wir aufhören, Proben an konventionelle Mikroskope anzupassen, indem wir sie dünn präparieren. Stattdessen ist es sinnvoller, biologisch und medizinisch relevante Proben in den Mittelpunkt zu stellen und Mikroskope „um diese herum“ zu bauen. Nur so können wir Experimente durchführen, die die dreidimensionale, naturnahe Integrität der Proben erhalten.

Essays
Illustration: Tim Teebken

Die Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) kommt diesem Ideal sehr nah. Sie verfügt über eine hervorragende Eindringtiefe in biologische Strukturen und reduziert den Energieeintrag, der für die Beobachtung einer dreidimensionalen Probe nötig ist, um zwei bis vier Größenordnungen. Die embryonale Entwicklung der Fruchtfliege können Fliegenforscher in einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop nur wenige Stunden mit etwa tausend Bildern beobachten. Mit der LSFM ist es dagegen möglich, die Embryogenese von Insekten und Fischen, die Formierung von Sphäroiden und die Organogenese in Pflanzen (in bis zu einer Woche lang dauernden Experimenten) mit mehreren Millionen hochauflösender Bilder zu verfolgen. Selbst die sehr frühe Entwicklung empfindlicher Mausembryonen ist mit der LSFM auf subzellulärer Ebene zu erkennen.

Wenn man bedenkt, dass Wissenschaftler die Fluoreszenzmikroskopie seit über hundert Jahren und die moderne ­Epifluoreszenzmikroskopie seit fünfzig Jahren zur Untersuchung biologischer Proben verwenden, wird ersichtlich, dass eine so massive Verbesserung der Aufnahmebedingungen eine Revolution in der Mikroskopie darstellt.

Das LSF-Mikroskop besteht in erster Linie aus der Beobachtungseinheit, die der eines Epifluoreszenzmikroskops sehr stark ähnelt. Das Fluoreszenzlicht wird mit einem Mikroskopobjektiv, einem Fluoreszenzfilter, einer Tubuslinse und schließlich einer Kamera aufgenommen. Es fehlt jedoch der dichroitische Spiegel, da das Anregungslicht nicht über das gleiche Mikroskopobjektiv eingekoppelt wird und damit auch nicht von oben (epi) in die Probe fällt.

Bei der LSFM wird das Anregungslicht über einen zweiten, unabhängigen Lichtpfad geführt und von der Seite in die Probe einstrahlt. Eine Zylinderlinse formt aus dem Lichtstrahl eine Scheibe, beziehungsweise ein Blatt, das sich eng um die Fokalebene der Beobachtungsoptik schmiegt. Dies hat zur Folge, dass nur Fluorophore angeregt werden, die sich in der Fokalebene befinden. Fluorophore, die von dem Mikroskopobjektiv der Beobachtungsoptik aus gesehen vor oder hinter dieser Ebene liegen, empfangen kein Licht und werden nicht angeregt. Sie können deshalb weder ausbleichen noch zum Bild beitragen.

Dagegen durchdringt das Anregungslicht in einem konventionellen oder konfokalen Epifluoreszenzmikroskop die gesamte Probe und regt (auf Grund der Energieerhaltung) in jeder Ebene die gleiche Anzahl von Fluorophoren an. Das bedeutet, dass bei jeder Aufnahme nicht nur die Fluorophore in der fokussierten Ebene angeregt werden, sondern alle Fluorophore in der Probe. Benötigt man zum Beispiel hundert Aufnahmen, um einen dreidimensionalen Datensatz aufzuzeichnen, dann wurden die Fluorophore in der Mitte (also in der fünfzigsten Ebene), bereits 49 Mal angeregt, bis sie im Fokus liegen.

Bei der LSFM wird ausschließlich der Probenanteil beleuchtet, der in der Fokalebene des Detektionssystems liegt. Der hieraus resultierende „Gewinn“ für die Probe lässt sich in Zahlen fassen. Er ergibt sich aus dem Verhältnis von Proben- und Lichtscheibendicke und liegt zwischen etwa zehn für Hefe und mehreren hundert für Fruchtfliegen- und Zebrafischembryonen. Da konfokale Fluoreszenzmikroskope zudem eine Lochblende benötigen und ihre Detektoren nicht so effizient sind wie moderne Kameras, ist ein zusätzlicher Faktor der Belastung mit Lichtenergie von fünf bis fünfzehn zu berücksichtigen.

Will man zum Beispiel von einem Insektenembryo Datensätze mit einer vergleichbaren Qualität aufnehmen, so benötigt man mit einem konventionellen Mikroskop gut zweihundert Mal, mit einem konfokalen Mikroskop sogar etwa dreitausend Mal so viel Lichtenergie, wie mit einem LSFM. Mit anderen Worten: verwendet man ein LSF-Mikroskop, so steht ein mehrere tausend Mal höheres „Photonenbudget“ zur Verfügung, das man gegen mehr Aufnahmen, ein besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis oder eine höhere Auflösung einlösen kann.

Da ein konventionelles Fluoreszenzmikroskop keine axiale Auflösung aufweist, sollte man LSF-Mikroskope eher mit konfokalen Fluoreszenzmikroskopen vergleichen. Bei diesen verringert eine Lochblende vor dem Detektor das Eindringen von außer-fokalem Fluoreszenzlicht. Beim LSF-Mikroskop werden dagegen nur Fluorophore anregt, die zum Bild beitragen.

Das konfokale Mikroskop tastet die Probe langsam Bildelement für Bildelement ab. In LSF-Mikroskopen erfasst eine Kamera, die eine Quanteneffizienz von bis zu 90 Prozent und eine Dynamik von mehreren tausend Grauwerten erreicht, Millionen Bildelemente parallel und mit einer hohen Verweildauer.

Konfokale Mikroskope nehmen alle paar Sekunden ein Bild auf, während LSF-Mikroskope mehrere hundert Bilder pro Sekunde schießen können und Millionen Einzelbilder der Probe aufnehmen.

Bei der LSF-Mikroskopie haben sich stationäre Probenkammern durchgesetzt, die typischerweise mit einem wässrigen Immersionsmedium gefüllt sind, sowie Präparationstechniken, die die dreidimensionale Struktur der Probe bewahren. Die Proben überstehen selbst langwierige LSFM-Experimente ohne Schäden, wobei sie um eine Achse rotieren (die möglichst parallel zur Gravitation ausgerichtet ist), um das Objekt aus mehreren Richtungen beobachten zu können.

Bei der LSF-Mikroskopie erstellt man dreidimensionale Datensätze einer Probe, indem man Probe und Lichtscheibe relativ zueinander bewegt, während das emittierte Fluoreszenzlicht mit einer empfindlichen Kamera aufgezeichnet wird. Die Objektgröße wird hierbei durch den Arbeitsabstand der Objektive bestimmt. Dieser liegt bei wenigen Mikrometern (zum Beispiel für Mikrotubuli-Astern, Pilze oder Hefezellen), mehreren hundert Mikrometern (etwa für Epithelzell-Zysten oder endotheliale Sphäroide) oder Millimetern (für die Insekten-, Fisch- oder Mausembryogenese).

Die Wahl der Objektivpaare hängt vom notwendigen Arbeitsabstand, dem für die Einbettung der Probe benötigten Material (zum Beispiel Agarose, Flüssig- oder Gasmedien) sowie der erforderlichen Größe des Sichtfelds ab.

Auch organische Moleküle, die für den Metabolismus der Zellen wichtig sind, bleiben im LSFM intakt. In Verbindung mit dem linearen Beleuchtungssystem und einem typischen Energiefluss von weniger als 1 nW/µm2 werden sowohl phototoxische Effekte als auch das Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe drastisch reduziert. Daher eignet sich die LSFM ausgesprochen gut für die dreidimensionale Beobachtung dynamischer und empfindlicher biologischer Prozesse in vivo.

Das LSF-Mikroskop ähnelt in seinen Grundzügen dem „Ultramikroskop“ (einem konsequenten Dunkelfeldmikroskop), das der an der Göttinger Universität arbeitende Chemiker Richard Zsigmondy 1903 gemeinsam mit dem Physiker Henry Friedrich Wilhelm Siedentopf entwickelte und für die Detektion von Goldpartikeln im Nanometermaßstab einsetzte. Aber erst der 1961 erfundene Laser ermöglichte diffraktionslimitierte Punkt-, Linien- und Flächenbeleuchtungen.

So schlugen 1993 Steffen Lindek und Ernst Stelzer vom Heidelberger EMBL diverse Punkt- und Linienbeleuchtungen in den von ihnen konstruierten Theta-Mikroskopen vor (Stelzer & Lindek, Opt. Comm., 111, 536-47). Arne Voie und Francis Spelman von der Universität Washington, USA, konstruierten 1993 ein ­Flächen-beleuchtendes Makroskop (Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning) zur Untersuchung der Cochlea. Daniel Huber und seine Kollegen von der Universität Lausanne rekonstruierten 2001 millimetergroße Proben mit Hilfe von Streulicht. Jules Jaffes Gruppe am Scripps Institut für Oceanography entwickelte 2002 schließlich ein „Thin Light Sheet“ Mikroskop zur Analyse ozeanischer Mikroben.

Das erste Fluoreszenzmikroskop auf Basis einer Lichtscheibe wurde jedoch erst 2002 von Ernst Stelzers Gruppe am EMBL in Heidelberg realisiert und seitdem hundertfach eingesetzt.

Technisch umgesetzt wurde das Konzept der Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie auf verschiedene Weise: Zum einen mit SPI-Mikroskopen (single/selective plane illumination microscope) zum anderen mit DSL-Mikroskopen (digital scanned laser light sheet-based fluorescence microscope).

Im SPIM leuchtet die diffraktionslimitierte Lichtscheibe immer das gesamte Bildfeld aus. Zylinderlinsen fokussieren den gebündelten (kollimierten) Laserstrahl entlang einer Achse. An verschiedenen Positionen entlang der Beleuchtungsachse sind Blendenpaare angeordnet, um die numerische Apertur der Beleuchtung und die Höhe des Sichtfeldes zu kontrollieren. Da die Lichtscheibe statisch ist, kann ihre Intensität beliebig schnell moduliert werden. Sie eignet sich deshalb besonders gut dazu, sehr viele Bilder mit kurzer Belichtungszeit aufzunehmen.

Beim DSLM wird zu jeder Zeit immer nur ein Teil des Bildfeldes (mindestens eine Linie) ausgeleuchtet. Kippspiegel bewegen einen kollimierten Laserstrahl entlang einer Achse, um eine Lichtscheibe zu erzeugen. Das DSLM benötigt keine Blenden und liefert eine weitgehend inkohärente und gleichmäßige Beleuchtung der Probe. Dank einer ortsabhängigen Lasermodulation sind strukturierte Beleuchtungs-Modi einfach zu realisieren.

Aufgrund des Rotationsfreiheitsgrads ist es möglich, dreidimensionale Datensätze des Probenvolumens entlang verschiedener Richtungen aufzuzeichnen. Diese unabhängig voneinander aufgenommenen Bildstapel können anschließend zu einem einzelnen dreidimensionalen Bild fusioniert werden. Hierdurch verbessert sich sowohl die Eindringtiefe in die Probe als auch die axiale Auflösung. Die Auflösung ist entlang aller drei Raumrichtungen gleich und hängt vom lateralen Auflösungsvermögen des Detektionssystems ab. Sie erreicht etwa 200 Nanometer Diese räumliche Isotropie ist ausschlaggebend für die präzise quantitative Charakterisierung dreidimensionaler Strukturen.

Wie bereits erwähnt, kann man mit LSF-Mikroskopen mehrere Tausend Mal mehr Bilder aufnehmen als mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Dabei sind über Tage dauernde Aufnahmen nur eine Möglichkeit, das Photonenbudget zu verprassen. Genauso gut kann man die gleiche Ebene wiederholt aufnehmen oder das zeitliche und räumliche Rauschen aufzeichnen, um tausende Fluoreszenzkorrelationsspektren zu erhalten. ­Fluoreszenzlebenszeitmessungen oder die Kombination mit höchstauflösender Mikroskopie sind ebenfalls möglich.

Warum ist es wichtig, die LSF-Mikroskopie zu verwenden? Mit ihr ignoriert man die Probleme der Fluoreszenzmikroskopie nicht. Ganz im Gegenteil, man adressiert und löst sie. Zudem findet man neue Wege für die Präparation und den Umgang mit Proben. Drüber hinaus sind mit LSF-Mikroskopen vollkommen neue Experimente möglich, über die man in der Vergangenheit nicht einmal nachdenken konnte. Der Vorteil eines neuen Instruments kann ja auch nicht darin bestehen, die alten Experimente zu wiederholen, nur um schönere Bilder zu erzeugen.

Fundamental neu ist, dass die LSF-Mikroskopie den Einstieg in die dreidimensionale Mikroskopie ermöglicht, weil Daten, Bilder oder Bildstapel, als Funktion der Zeit in drei Dimensionen aufgenommen werden.

Das Ganze ergibt natürlich nur Sinn, wenn die Proben entsprechend präpariert werden. Wir arbeiten nicht mehr mit Zellen, die auf Deckgläsern oder anderen harten Oberflächen fixiert sind. Wir wollen Zellen untersuchen, die auf anderen Zellen wachsen und im engen Kontakt mit diesen stehen. Wir sind daran interessiert, multizelluläre Strukturen und Zellverbände zu erforschen.

Wir glauben daran, dass das Leben ganz wesentlich durch die Interaktionen zwischen den Zellen bestimmt wird. Wir sind auch fest davon überzeugt, dass es in Zukunft immer weniger Sinn ergeben wird, mit einfachen zweidimensionalen Zellkulturen zu experimentieren.

Uns ist natürlich klar, dass wir uns mit dieser Sichtweise nicht nur Freunde machen. Letztendlich erzählen wir der Wissenschaftsgemeinde, dass viele der Erkenntnisse, die in den letzten Jahrzehnten scheinbar gewonnen wurden, noch einmal sorgfältig überprüft werden sollten. Viele Experimente werden aber auch durch weitere Wiederholungen keinen Sinn ergeben. Aber welche Revolution hat nur Freunde gehabt?


Letzte Änderungen: 07.07.2015

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