Nicht nur für Schmuckhersteller interessant: Mit fluoreszenzgefärbten Beads beziehungsweise Microsphären kann man auch der qPCR auf die „Multiplex“-Sprünge helfen.
Bei der quantitativen Real-Time PCR hatte man bisher die Wahl zwischen den SYBR Green- und TaqMan-Systemen. Eine neue, multiplexfähige Variante macht den beiden Konkurrenz.
Mit der quantitativen Real-Time PCR (qPCR) kann man die Ausgangsmenge der amplifizierten Template-DNA sehr exakt bestimmen. Weil man so auch feinste Unterschiede bei der Expression von Genen nachweisen kann, ist sie die bevorzugte Methode für Genexpressions-Studien.
Gegenwärtig nutzen Biowissenschaftler zwei unterschiedliche qPCR-Verfahren: das SYBR Green- und das TaqMan-System. Ersteres basiert auf der Bindung des Fluoreszenzfarbstoffes SYBR Green I an beliebige DNA-Sequenzen und der Messung des im Verlauf der qPCR-Zyklen immer stärker werdenden Fluoreszenz-Signals. Mit dem SYBR Green-Verfahren sind jedoch keine multiplexen qPCR-Reaktionen möglich, bei denen man mehrere Ziele in einem Reaktionsansatz gleichzeitig analysiert.
Mit dem TaqMan-System ist Multiplexing zwar prinzipiell möglich. Will man damit jedoch mehr als nur eine Handvoll Zielgene untersuchen, wird das Verfahren mit jedem weiteren Target komplizierter und zeitaufwändiger. Das grundlegende Vorgehen bei der TaqMan-qPCR ist aber recht einfach. Neben einem Vorwärts- und einem Reversen Primer-Oligo verwendet man ein drittes, sequenzspezifisches Oligo, das innerhalb des von Vorwärts- und Reversen-Primer vorgegeben Abschnitts an den Template-Strang hybridisiert. Dieses Oligo beherbergt einen Fluoreszenz-Farbstoff am 5‘-Ende, der durch einen Quencher am 3‘-Ende darin gehindert wird, zu fluoreszieren. Sobald die Taq-Polymerase die Primer verlängert, stößt sie auf das dritte Oligo und entfernt zunächst den Fluoreszenz-Farbstoff von dessen 5‘-Ende. Anschließend schmeißt sie das restliche Oligo von der Template herunter, um den Vorwärts-Primer lückenlos verlängern zu können.
Ohne den störenden Quencher fluoresziert der abgelöste Fluoreszenzfarbstoff munter vor sich hin und signalisiert dadurch die Herstellung eines PCR-Amplikons. Aus den im Verlauf der qPCR-Zyklen stärker werdenden Fluoreszenz-Signalen lässt sich somit die Ausgangsmenge der DNA-Vorlage rekonstruieren.
Inzwischen gesellte sich eine dritte, multiplextaugliche qPCR-Variante zu SYBR Green- und TaqMan-qPCR, die sich die Gruppe des australischen Virenforschers Ross Barnard ausdachte (Lai et al., Anal. Biochem, 2012; Liang et al., Anal. Biochem., 2013, 432, 23-30). Das Team von der Universität Queensland nennt ihre Methode Multiplex-Microsphären-qPCR. Hinter diesem sperrigen Begriff verbirgt sich eine clevere Kombination aus fluoreszenzmarkierten Styrolkügelchen (Microsphären, Beads) und einer qPCR.
Statt drei Oligos wie bei der TaqMan-Methode benötigt man bei der Microsphären-qPCR vier. Am schnellsten in Auftrag gegeben ist der reverse Primer, der ohne Fluoreszenz-Anhängsel oder sonstigen Schnick-Schnack auskommt. Dagegen hängt am 5‘-Ende des Vorwärts-Primers noch ein Fitzelchen DNA, das die Australier TM-Sequenz nennen.
Das trickreiche an der Methode sind jedoch die zwei zusätzlichen Proben-Oligos, die Barnards Gruppe als Microsphären-veknüpftes Proben-Oligo (Bead-Oligo) und reverses Reporter Proben-Oligo (Reporter-Oligo) bezeichnet. Ersteres besteht aus der TM-Sequenz (mit einer ausgetauschten Base im zentralen Abschnitt der Sequenz), die am 5‘-Ende mit einem fluoreszenzgefärbten Polystyrolkügelchen des Luminex-Systems verknüpft ist. Die Sequenz des Reporter-Oligos ist komplementär zur TM-Sequenz und ist am 5‘-Ende mit einem fluoreszierenden Anhängsel (Cy3) versehen.
Schmeißt man DNA-Template, Primer und Proben-Oligos sowie die weiteren Zutaten für die qPCR in einen Topf, passiert zunächst nicht viel. Das Entscheidende in dieser Phase ist, dass das Reporter-Oligo an die komplementäre TM-Sequenz des Vorwärts-Primers hybridisiert, wodurch die Cy3-Fluoreszenz unterdrückt wird. Jetzt wird auch klar, was der Einzelbasen-Austausch im Bead-Oligo für einen Zweck hat. Er soll ganz einfach verhindern, dass Bead- und Reporter-Oligo vorzeitig hybridisieren.
Interessant wird es mit den ersten qPCR-Zyklen. Beim Aufschmelzen der Template-DNA werden auch Vorwärts-Primer und Reporter-Oligo getrennt. Der Vorwärts-Primer hybridisiert nachfolgend mit dem entsprechenden Einzelstrang der Template-DNA und wird verlängert, während sich das freigesetzte Reporter-Oligo an die komplementäre Sequenz des Bead-Oligos anlagert. Der Cy3-Farbstoff kann dadurch wieder ungehindert fluoreszieren.
Mit zunehmender Zahl der qPCR-Zyklen und der damit einhergehenden Synthese des PCR-Produktes verringert sich die Zahl der Vorwärts-Primer. Das bedeutet aber auch, dass immer mehr Reporter-Oligos mit Bead-Oligos hybridisieren und das Fluoreszenz-Signal mit jedem Zyklus stärker wird. Gemessen wird das Fluoreszenz-Signal in einem Luminex-Gerät. Da dieses bis zu hundert verschiedene fluoreszenzgefärbte Beads auseinanderhalten kann, können mit dieser Methode theoretisch 100 Zielgene in einem Reaktionsansatz analysiert werden.
Nachdem die Australier zunächst die optimalen Reaktionsbedingungen für die Microsphären-qPCR austesteten, führten sie mit dieser „Singleplex“ und Triplex-qPCRs durch und verglichen die Ergebnisse mit denen einer TaqMan-qPCR. Als Ziele dienten hierbei zwei Gene aus Neisseria meningitides und eines aus dem Influenza A Virus. Dabei stellte sich heraus, dass die Microsphären-basierte qPCR etwas höhere Mg2+-Konzentrationen (8.5 bis 11.5 mM) benötigt um optimal zu funktionieren.
Auch in einem weiteren, wesentlicheren Punkt unterschied sie sich von der TaqMan-qPCR: die Empfindlichkeit ist bei der Singleplex-Reaktion etwas geringer. So lag das untere Limit für den Nachweis des M Gens aus Influenza A bei der Microsphären-basierten-qPCR bei 5850 Kopien, während die Detektionsgrenze bei der TaqManqPCR bei 585 Kopien lag.
Auch bei der Triplex-qPCR war die Sensitivität der Microsphären-basierten-qPCR etwas niedriger. Dieses kleine Manko dürfte aber durch das Multiplexing-Potential dieser Methode mehr als ausgeglichen werden.