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Farbverschiebungen

Spezial: Ramanmikroskopie

Andrea Pitzschke


Lange Zeit dachten Biologen, die Ramanspektroskopie wäre nur etwas für hartgesottene Chemiker und Materialwissenschaftler. Spätestens seit aus der Ramanspektrokospie die Ramanmikroskopie wurde, hat sich dies jedoch gründlich gewandelt. Die Technik ist zwar immer noch etwas tricky und kostet auch Geld. Sie eröffnet Biologen und Medizinern jedoch neue faszinierende Einblicke in Zellen.

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Diese Raman-Karte eines marinen Bakteriums zeigt die Verteilung von Energiespeicher-Molekülen innerhalb der Zelle. In den roten Arealen lagert das Bakterium Polyhydroxybutyrat ein, dessen Raman-Spektrum unten rechts zu sehen ist. In den blauen Zonen dominieren dagegen Aminosäuren (blaues Spektrum) sowie Proteine. Foto: Stony Brook University

Die Ramanspektroskopie beruht auf der Messung der inelastischen Streuung von Photonen an Molekülen, die Chandrasekhara Venkata Raman, 1928 entdeckte. Trifft monochromatisches Licht aus einem Laser auf ein Objekt, zum Beispiel eine Zelle, so interagieren die Photonen mit der Probe. Die Photonen regen Moleküle zur Schwingung an und können dabei Energie abgeben oder aufnehmen.

Die Energiedifferenz zwischen auftreffendem und emittiertem (gestreutem) Photon entspricht der Energiemenge, die zur Anregung einer bestimmten Molekülschwingung nötig ist. Die entsprechenden Frequenzverschiebungen sind messbar. Im Raman-Spektrum stellen die einzelnen Banden alle Frequenzunterschiede dar, die sich aus den verschiedenen chemischen Bindungen und funktionellen Gruppen eines Moleküls ergeben.

Auch wenn der Raman-Effekt wesentlich schwächer und seltener ist als die elastische Streuung (Rayleigh-Effekt), liefert er detaillierte Informationen. Jedes Molekül hat sein eigenes Spektrum, einen „molekularen Fingerabdruck“. Je stärker dieser Abdruck (Bandenausschlag im Spektrum), desto höher ist die Konzentration der Molekül(-bindungen), die den Effekt verursachen. Raman-Spektren biologischer Proben sind aufgrund der immensen Molekülvielfalt sehr komplex. Kann man einem Raman-Spektrum aber präzise Ortskoordinaten zuordnen, wird die Komplexität überschaubarer.

Vor circa zwanzig Jahren löste die Kombination von Ramanspektrometer und Konfokalmikroskop das ursprünglich verwendete „Raman-Mapping“ (Messung der Raman-Streuung an einzelnen Stellen) ab und erzeugte mit der Konfokalen Ramanmikroskopie erstmals Bilder. Hierzu wird ein Objektträger mit Probenmaterial durch die Linse eines umgebauten Konfokalmikroskops mit Laserlicht angeregt. Der Laserstrahl tastet die Probe rasterförmig ab und erzeugt für jede Position ein Streusignal. Diese werden von einem angeschlossenen Spektrometer analysiert und von einer angeschlossenen CCD-Kamera aufgezeichnet. Nimmt man das Ramanspektrum jedes einzelnen Pixels auf, kann man daraus mit Hilfe spezieller Software ein Bild erstellen, das zeigt, welche Substanz an welcher Stelle sitzt.

Da das Konfokalmikroskop störendes Streulicht ausschließt, das aus den Arealen unter- oder oberhalb der Fokusebene stammt, sind für transparente Materialien auch 3D-Aufnahmen prinzipiell möglich. Hierzu misst man verschiedene Fokusebenen transparenter Proben und setzt sie, ähnlich wie bei der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie, zu einem 3D-Bild zusammen.

Physikalische Grenzen

Die spektrale Auflösung hängt von der Brennweite des Spektrometers, der Liniendichte des Spektrometer-Gitters sowie der Pixelgröße der CCD-Kamera ab. Die räumliche Auflösung ist von der Apertur des Mikroskops abhängig. Sie ist physikalisch etwa durch die Hälfte der eingesetzten Wellenlänge begrenzt, für Einzelmoleküle wie zum Beispiel Hämoglobin (5nm) oder DNA (Dicke 2 nm) ist sie also zu schwach. Mit einem blauen Laser (480 nm) kann man zum Beispiel bis 300 Nanometer kleine Objekte erkennen und gleichzeitig untersuchen, was sich innerhalb eines 300 Nanometer Umkreises an Substanzen befindet.

Die Konfokale Ramanspektromikroskopie füllt eine Nische in der Lebendzellanalyse. Anders als sonstige Zellmikroskopieverfahren liefert sie Informationen zur chemischen Struktur der Zellbestandteile. So kann beispielsweise zwischen DNA, Lipiden und Proteinen differenziert werden, weil sich die Streuungsmuster prinzipiell unterscheiden.

Ein Vergleich mit alternativen Methoden zeigt ihre Vorteile. So müssen die Zellen zum Beispiel bei der Elektronenmikroskopie fixiert werden, liefern vom Innenleben der Zellen also nur eine Momentaufnahme. Die Durchlichtmikrokopie, die ohne fixierte Zellen auskommt, unterscheidet dafür nicht zuverlässig zwischen DNA-Knäuel, Protein-Klumpen oder Staubkorn. Ihr Vorteil ist aber, dass Bilder sofort generiert werden, so dass Proben dem Lichtstrahl nur kurz ausgesetzt sind. Bei der Fluoreszenzmikroskopie können die höchstauflösenden Methoden Einzelmoleküle erkennen, setzen aber ein ausgeklügeltes Anfärben beziehungsweise Labelling und/oder eine genetische Manipulation der Zellen voraus.

Langes Warten

Eine wirklich harte Nuss sind die relativ langen Integrationszeiten (Belichtungszeiten), die für die Ramanmikroskopie notwendig sind. Denn nur etwa eines unter zehn Millionen Photonen liefert ein Streusignal. Die Laserstrahlung einfach zu intensivieren, wäre bei sensiblen biologischen Proben aber keine so gute Idee.

In fixierten Proben, etwa zur Diagnostik von gut- und bösartigem Gewebe, lassen sich die Zellbestandteile aufgrund ihrer unterschiedlichen Spektren unterscheiden. Die DNA verrät sich durch Phosphor-Sauerstoff-Verbindungen, Lipide anhand der Kohlenstoff-Doppelbindungen und Proteine aufgrund ihrer Amid-Bindungen. Das für Cytochrom c typische Spektrum gibt den Standort der Mitochondrien preis.

Man erfährt jedoch nur, um welche Molekültypen es sich handelt. Da hochmolekulare Stoffe sehr komplex und C-N- oder C=O-Bindungen quasi omnipräsent sind, ist es nicht immer einfach und manchmal auch unmöglich, einzelne Molekülarten voneinander zu unterscheiden. Krebszellen und gesunde Zellen, oder auch unterschiedliche Zelltypen, haben individuelle Spektren, lassen sich also mit entsprechenden Referenzspektren klassifizieren, auch ohne die zugrundeliegenden Moleküle beim Namen nennen zu können.

Die Erkenntnis, dass die Fixierung, zum Beispiel in Formalin, die Spektren mitunter verzerrt, führte zu Direktanalysen von Lebend-Proben (Analyst 141(12): 3590-600). Hier dürfen sich Pflanzen- oder Tierzellen in Wasser, PBS oder sonstigen Medien tummeln, was zum Beispiel bei Infrarotspektroskopie-Techniken unmöglich ist.

Je kurzwelliger das Licht, desto schädlicher ist es für biologische Proben. Sie werden deshalb mit einem 785 nm-Laserstrahl sanft abgetastet. Damit die Zellen gar nicht erst mitbekommen, dass sie „unter Beobachtung“ stehen, können Ramanspektrometer in Zellinkubatoren integriert werden.

Seltenes Ereignis

Dass die Raman-Streuung selten auftritt und die Aufnahmen Zeit benötigen muss man akzeptieren. Ansonsten schreitet die Optimierung von Geräten und Protokollen zügig voran. An den Raman-Geräten selbst gibt es viele Stellschrauben: die Wellenlänge des Lasers, die Konfokalität, die Apertur des Objektivs, Gitter und Brennweite des Spektrometers sowie die Kameraempfindlichkeit (Signal-Rausch-Verhältnis). Objektträger aus Glas sind zwar billig, fordern aber Abstriche beim Kontrast. In wiederverwendbare Alternativen aus Bariumfluorid, Calciumfluorid oder Quartz zu investieren, lohnt sich mitunter, auch wenn Kosten und Logistikaufwand etwa bei medizinischen Hochdurchsatzexperimenten ordentlich zu Buche schlagen.

Hinsichtlich der Laserfrequenz ist die Ramanmikroskopie ein Balanceakt. Kurze Wellenlängen (hohe Frequenzen) liefern stärkere Signale, schädigen aber die Probe bei längeren Wellenlängen sind die Signale schwach. Auch die Kamerawahl ist nicht ganz einfach: Von vorn aufnehmende CCD-Kameras sind billiger, erzeugen aber mehr Hintergrundrauschen. Bei von hinten aufnehmenden Kameras ist es genau umgekehrt. An jedem Spiegel und Gitter verliert man Signalstärke, optische Glasfasern sollen deshalb Kopplungsverluste begrenzen.

Der Knackpunkt zur Optimierung von Raman-Experimenten ist aber die Integrationszeit. Je länger und intensiver die Bestrahlung, desto höher die Gefahr, dass Zellen „geschmort“ werden (im Spektrum als amorphe Carbon-Banden erkennbar). Zwar rastert das Mikroskop die Probe punktförmig ab, doch Gewebe können mitunter auch auf eine punktuelle Belichtungen empfindlich reagieren.

Abgestimmte Frequenz

Die Integrationszeiten pro Spektrum beziehungsweise pro Pixel liegen je nach Gerät zwischen zehn und hundert Millisekunden. Je länger man integriert, desto klarer die Spektren und schöner die Bilder. Ein Trick mit dem sich die Integrationsdauer weiter reduzieren lässt, um zum Beispiel auch sehr gering konzentrierte Proben messen zu können, ist die Ausnutzung des Resonanzeffekts. Bei dieser Technik wird die Frequenz des Lasers genau auf die Elektronenanregung des zu detektierenden Molekültyps abgestimmt. Hierdurch erhöht sich nicht nur die Raman-Streuung sondern auch der Kontrast. Für Hämproteine funktioniert das zum Beispiel prima (Journal of Raman Spectroscopy 44(8): 1061-76).

Der Experimentator muss sich jedoch auf seinen Ziel-Molekültyp beschränken und dessen Verhalten kennen. Und er benötigt einen Laser, bei dem man die Wellenlänge einstellen kann, oder ein entsprechendes Filterset.

Auch das SILAC-Verfahren (Stable Isotope Labelling), das sich vor allem für Aminosäuren eignet, verkürzt die Aufnahmedauer. Ein Isotop verursacht bei dieser Technik einen charakteristischen Shift der Raman-Bande. Bauen lebende Zellen die gelabelte Aminosäure ein, lassen sich de novo-synthetisierte Proteine orten.

Die SERS-Technik (Surface Enhanced Raman Spectroscopy) verkürzt die Aufnahmedauer, indem sie die Signale mit kritischer Intensität schneller sammelt. Metallische Nanopartikel, meist Silber oder Gold, in unmittelbarer Nähe zur Probe interagieren mit eintreffenden Photonen und verstärken das entstehende elektrische Feld. Je rauer die Partikel, desto größer der Effekt. Die Raman-Streuung der betroffenen Moleküle verstärkt sich gewaltig (bis zu Faktor 1014). Dafür müssen Metallpartikel und Lebendmolekül eng beisammen liegen, was am besten durch die Inkubation der Zellen mit Metallkolloid-Suspensionen gelingt.

Datenwust

Die binnen Minuten entstehenden Datenberge abertausender Spektren kann nur eine ausgeklügelte Software verständlich aufbereiten. Schon beim Scannen eines 13 Mikroliter großen Emulsionströpfchens mit 200x200x50 Pixeldaten und einer Integrationszeit von je 10 Millisekunden kommt man in einer halben Stunde auf zwei Millionen Spektren mit einer Rohdatengröße von sechs Gigabyte.

Die Auswertesoftware, die auf gängigen Standard-PCs läuft, liefern kommerzielle Anbieter zusammen mit Ramanspektrometer, Konfokalmikroskop und CCD-Kamera gleich mit. Den nötigen Zutritt zur Datenbank, um eigenen Spektren anhand dokumentierter S­ub­­stanz-spezifischer Spektren eine Identität zuzuordnen (ähnlich HPLC) muss man sich zusätzlich beim Anbieter erkaufen. Die „Tätersuche“ durch händisches Durchwühlen von Publikationen ist nur etwas für extrem zähe Wissenschaftler mit einer gewissen Vorahnung.

Die Ramanmikroskopie lässt sich prima mit anderen bildgebenden Verfahren kombinieren, etwa der Rasterkraftelektronenmikroskopie (AFM), der Fluoreszenz- oder der Elektronenmikroskopie (SEM). Raman liefert chemische Informationen, AFM und SEM strukturelle.

Kombinierte Verfahren

Die kombinierte Raman-AFM oder Raman-SEM-Mikroskopie (RISE; Raman imaging and scanning electron microscopy) verknüpft die beiden Methoden, indem sie von der gleichen Probe AFM- beziehungsweise SEM- und Raman-Bilddaten sammelt. Das passiert nicht gleichzeitig, sondern nacheinander. Die Probe wird hierzu in einer Vakuumkammer automatisch zwischen beiden „Messstationen“ hin- und her gereicht. Die integrierte Software vereint schließlich alle Daten in einem gemeinsamen Bild. Anders als die Elektronenmikroskopie, bringt die Ramanmikroskopie auch die Kristallstruktur und Konformation von Molekülen ans Licht. Entsprechend interessant ist das Anwendungspotenzial kombinierter Raman-SEM-Systeme.

Die Ramanmikroskopie hat für sämtliche Teildisziplinen der Biowissenschaften etwas zu bieten. In der Medizin hat sie als nicht-invasive und Labelling-unabhängige Methode insbesondere unter Stammzellforschern Fuß gefasst (Epj Techniques and Instrumentation 2(1): 6).

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Raman-Mikroskopie-Aufnahmen lebender HeLa-Zellen und das entsprechende Spektrum. Das erste Bild von links zeigt die Verteilung von Cytochrom c beziehungsweise der Mitochondrien. Das zweite resultiert aus beta-Faltblättern von Proteinen. Das dritte Bild entsteht durch die Raman-Streuung an Kohlenwasserstoffbindung von Lipiden. Im vierten Bild sind die einzelnen Aufnahmen übereinander gelegt, um die Verteilung der Zellkomponenten zu verdeutlichen. Foto: Katsumasa Fujita

Stammzellkulturen sind sehr heterogen. Mit der Ramanmikroskopie können Forscher die gewünschten Zell-Exemplare zur Weiterkultivierung identifizieren. Sind die Beleuchtungszeiten des Laserstrahls entsprechend kurz, schadet dies den Zellen nicht. In einem Gemisch aus sich differenzierenden menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) identifiziert das Raman-Mikroskop beispielsweise Kardiomyocyten anhand von akkumuliertem Glycogen und Myofibrillproteinen. Solange der Experimentator beziehungsweise seine Auswertesoftware die charakteristischen Raman-Spektren molekularer Marker kennt, kann er einzelne Zellen identifizieren.

Identifikation von Zellen

Normale und krankhafte Zellen variieren hinsichtlich ihrer Zusammensetzung sowie ihrer Verteilung von Zellkomponenten. Gleiches gilt für Zelltypen in gesundem und krankem Gewebe. Mit der Raman-Mikroskopie lässt sich zum Beispiel feststellen, ob und welche Krebszellen auf therapeutische Antikörper reagieren.

Die Raman-Technologie erleichtert aber auch die Krebsdiagnose (Analyst 138(14): 4035-39). So beobachteten Pathologen bei Raman-Analysen mit einem 532-Nanometer-Laser von Darmgewebeproben krebskranker Patienten autofluoreszierende Zellkerne. Die Signale korrelierten mit dem (immunologisch detektierten) Krebs-Marker p53.

Pharmakologen wollen mit Toxizitäts-Tests an menschlichen Zellen unter wirklichkeitsnahen Bedingungen herausfinden, welcher Patient auf einen Wirkstoff anspricht. Auch hier ist die Ramanspektroskopie hilfreich.

Die Pharmabranche untersucht mit der Raman-Spektroskopie ob Pillenbestandteile ihre chemische Struktur auch nach der Lagerung beibehalten, chemisch reagieren oder gar verdampfen. Die Messung erfolgt in diesem Fall nur punktuell an der Oberfläche oder einem Schnitt der Probe.

Viele Möglichkeiten

Enantiomere (etwa Acetylsalicylsäure in Ibuprofen oder in Aspirin) unterscheiden? Die Verteilung von Molekülen in Emulsionen klären? Oder feststellen, wie welche Bestandteile einer Sonnenschutzlotion wie tief in die Haut eindringen? All das ist mit der Raman-Spektroskopie prinzipiell möglich. Details hierzu finden Sie zum Beispiel in einem aktuellen Review zu Anwendungen der Raman-Technologie in der Biopharmazeutischen Industrie (Appl Spectrosc 71(6): 1085-16).

Wer will, kann Bakterienstämme mit der Ramanspektroskopie ganz ohne Sequenzierung oder Ausstreichen auf zig verschiedenen Nährmedien einordnen. Solange sich die Stämme in ihrer Metabolit-Zusammensetzung unterscheiden und Referenzspektren vorliegen, geht auch das.

Ausgesprochen gewinnbringende Studienobjekte sind Magnetobakterien, die Eisen sammeln und so die für SERS-Aufnahmen nötigen Nanopartikel gleich selbst mitbringen. Vielversprechend ist auch die Idee, Nanopartikel als Biosensoren einzusetzen und Mikroorganismen sowie deren Toxine mittels Ramantechnologie aufzuspüren (Methods 68(2): 348-53).

Raman für‘s Feld

Wer nur die Spektroskopiedaten benötigt und Mikroskop und Kamera nicht braucht, findet mobile, handliche Raman-Geräte etwa für Feldversuche. Ein texanisches Forscherteam nutzte jüngst ein Ramansspektroskop (ohne Mikroskop) zum Fitnesstest von Pflanzen (PNAS 114(13): 3393-96).

Über einen Zeitraum von drei Tagen verfolgte es die Änderungen zweier Haupt-Antioxidantien in Stress-exponierten (Salz, Kälte, Trockenheit, Starklicht) Buntnesseln. Bekannt ist, dass radikale Sauerstoffspezies sich bei Stress anreichern und Pflanzen als sofortige Gegenmaßnahme Carotinoide und Anthocyane als Radikalfänger produzieren. Letztere tauchen in den Raman-Spektren als distinkte Banden auf, die mit biochemischen Analysen an Zellextrakten übereinstimmen.

Auch wenn es an der genauen Quantifizierung noch hapert, können Landwirte mit einem mobilen Raman-Spektrometer schon heute ins Feld ziehen und ihre Schützlinge aus bis zu zehn Zentimeter Entfernung untersuchen. Messen sie einen Anthocyan-Anstieg, können sie rechtzeitig handeln und zum Beispiel gießen. Die zukünftige Automatisierung solcher mobilen Messgeräte könnte es sogar ermöglichen die Beregnungs-, Heiz-, und Belüftungsanlagen genau an die pflanzlichen Bedürfnisse anzupassen.

Auch Biotechnologen bedienen sich der Ramanspektroskopie. So haben Forscher herausgefunden, dass sich Polyethylenterephthalat (PET) aus synthetischer Altkleidung durch Erhitzen unter Druck, gefolgt von enzymatischem Verdau mit Pilz-Cutinase, wieder in seine Polymer-Einheiten Terephtalsäure ( TA) sowie Ethylenglycol zerlegen lässt (Microb Biotechnol DOI: 10.1111). Dass das wiedergewonnene TA im Reinheitsgrad mit industriell synthetisiertem mithalten und als Ausgangsstoff für neues PET dienen kann, bewies das Team mittels Ramanspektroskopie.

Wer auf den Raman-Zug aufspringen will, findet auf entsprechenden Webseiten, wie zum Beispiel Raman4Clinics (www.raman4clinics.eu) oder CLIRSPEC (www.clirspec.org), sowie Symposien (www.raman-symposium.com) weitere Informationen.






Letzte Änderungen: 11.10.2017


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