Wer in der Vergangenheit Proteine ausschalten wollte, um ihre Funktion zu analysieren, musste den Umweg über das Genom oder die mRNA nehmen. Damit ist jetzt Schluss. Die Trim-Away-Methode markiert die ausgesuchten Proteine und liefert sie umgehend dem Häckselwerk des Proteasoms aus.
Um zu verstehen, welches Rädchen (Protein) in einem komplexen Getriebe (Zelle) welche Rolle spielt, schaut man sich am besten die „Was-wäre-ohne“-Situation an. Dafür gibt es prinzipiell drei Strategien: Den ursprünglichen Bauplan löschen, den Bauprozess blockieren oder das fertige Produkt im Nachhinein zerstören. In Molekularbiologen-Sprache übersetzt heißt das: DNA-Knock-outs generieren, RNAi-Silencing initiieren oder Proteine degradieren. Bei den ersten beiden Ansätzen kommt man um genetische Manipulationen nicht herum. Ohne Klonierungs- und Transformationsaufwand läuft da nichts, und kurzfristig wirkende, geschweige denn kontrollierbar reversible Eingriffe sind kaum möglich. Manchmal will man aber genau das: Ein endogenes Protein ratzfatz auf Kommando zum gewählten Entwicklungsstand entfernen, um beobachten zu können, wie Zellen, Zellstrukturen oder Signalwege auf den Verlust reagieren.
Mit der neuen Trim-Away-Methode, die Melina Schuhs Gruppe von der Uni Göttingen zusammen mit Wissenschaftlern des MRC in Cambridge, England, entwickelte, wird dieser Wunsch Realität (siehe hierzu auch das Interview mit Melina Schuh auf Seite 69). Schuhs Mitarbeiter setzen auf Antikörper zur Erkennung gewünschter Proteine und auf die Proteolyse für deren Beseitigung (Cell 172: 1-15).
Die Trim-Away-Technik macht sich die zelleigene Proteinabbau-Maschinerie zunutze und zerstört native Proteine binnen Minuten. Somit bleibt für das Aufkeimen etwaiger unspezifischer Effekte kaum Zeit. Zum Vergleich: Induzierbare Gen- und Transkriptmanipulationen wirken nur indirekt und zeitlich verzögert. Sie beseitigen zum Zeitpunkt X vorhandene Proteine nicht, sondern verhindern nur deren De-novo-Aufstockung. Stabile und in hoher Zahl vorliegende Proteine reagieren entsprechend träge.
Dagegen greift Trim-Away als akute Maßnahme ein, bevor etwaige Kompensationsmechanismen anspringen können. Ein weiterer Vorteil ist, dass auch sich nicht teilende Primärzellen auf die Manipulation ansprechen. Diese Zellen sind mit Methoden, die auf DNA und RNA abzielen, so gut wie unerreichbar.
Gänzlich neu sind Konzepte zur induzierten Protein-Inaktivierung nicht, die bestehenden haben aber einigen Optimierungsbedarf. So gibt es etwa Strategien, die eine vorherige Modifikation des Zielproteins voraussetzen, um es überhaupt manipulieren zu können. Andere kommen zwar ohne Modifikation aus, können aber nur auf eine Handvoll ausgewählter Kandidaten angewendet werden. Bestimmte Proteine mit chemischen Inhibitoren lahmzulegen, ist zwar eine ebenfalls sofort wirkende Maßnahme, doch vor Kollateralschäden (Off-target-Effekte) ist sie nicht gefeit. Eine universell anwendbare Strategie fehlte bisher.
Schuhs Team setzt bei der Trim-Away-Technik auf die drei stärksten Trümpfe von Antikörpern: hohe Affinität und Spezifität sowie Flexibilität. Die Antikörper sollen aber nicht einfach nur ausgewählte Moleküle lahmlegen. Dafür müssten sie mit den endogenen Liganden einen stöchiometrischen Konkurrenzkampf führen, sich Zugang zum meist verborgenen Zielmotiv verschaffen und in entsprechend großen Mengen vorliegen. Vielmehr heftet sich bei der Trim-Away-Strategie ein spezifischer Antikörper an sein Zielprotein und markiert es für den proteolytischen Abbau. Dreh- und Angelpunkt ist die E3-Ubiquitin-Ligase TRIM21, die eine hohe Affinität zur Fc-Domäne von Antikörpern hat. TRIM21 ist die sonstige Gestaltung des Antikörpers schnuppe, Hauptsache er hat eine Fc-Domäne.
Die Ubiquitin-Ligase wird normalerweise von verschiedensten Zelltypen und Geweben exprimiert und spielt in der Pathogen-Abwehr eine Rolle. In natura trifft ein Pathogen auf körpereigene Antikörper, TRIM21 klammert sich an die Fc-Domäne und rekrutiert so die Antikörper-gebundenen Pathogene zur zelleigenen Ubiquitin-Proteasom Metzelei.
Für einen ersten experimentellen Beweis, dass ihre Strategie funktioniert, nutzten die Forscher NIH 3T3-Zellen (Mausfibroblasten), die ein mCherry-TRIM21-Konstrukt sowie GFP exprimierten. Den Zellen verabreichten sie mittels Mikroinjektion Anti-GFP-Antikörper (beziehungsweise IgG als Kontrolle). Anschließend verfolgte die Gruppe den GFP-Abbau anhand von Zeitraffer-Aufnahmen mit dem Fluoreszenz-Mikroskop, kurz vor, und in fünfminütigen Intervallen nach der Mikroinjektion.
Koppelt man Kamel- oder Alpaka-Nanobodies an die Fc-Domäne, funktioniert Trim-Away auch bei Proteinen, die im Zellkern lokalisiert sind. Foto: MPG
Nach 17 Minuten war bereits die Hälfte der GFPs zerkaut, nach einer Stunde waren kaum mehr welche übrig. Dass hier tatsächlich das zelleigene Proteasom werkelte, belegten die Forscher in Parallelexperimenten mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 beziehungsweise DMSO (Kontrolle). Kontrollzellen erlitten das oben beschriebene Schicksal, in MG132-behandelten Zellen blieb GFP dagegen heil; ebenso wie in Zellen mit einer defekten TRIM21-Variante.
Post-mitotische Primärzellen „schlafen“ gewöhnlich, das heißt, sie sind transkriptionell inaktiv und für Nukleinsäure-Manipulationen zur Beseitigung von Genprodukten nicht zugänglich. Sie horten zudem meist große Proteinmengen, sodass RNAi-Eingriffe wenig bringen. Für die TRIM-Away-Strategie ist der Dornröschenschlaf offenbar keine Hürde, denn ganz ähnlich wie die Fibroblasten reagierten TRIM21-exprimierende Maus-Eizellen auf die Antikörperinjektion mit einer flotten Abnahme des Zielproteins GFP.
Um sicherzustellen, dass heikle Geschöpfe wie Eizellen durch den Eingriff keine Entwicklungsstörungen davontragen, untersuchte das Team eine etwaige Beeinflussung der Meiose. TRIM21-Überexprimierer blieben unauffällig, der Zeitverlauf und die Effizienz verlief wie in den Kontrollzellen.
mCherry-TRIM21 co-lokalisierte mit GFP, gemäß der Theorie, dass TRIM21 sich an (anti-GFP)-Antikörper und somit indirekt an GFP klammert. Interessanterweise kam es nach der Antikörperinjektion aber nicht nur zum gewünschten Abbau des Zielproteins GFP. Auch mCherry-TRIM21 sowie die eingeschleusten Antikörper gingen sukzessive zugrunde. Hat man es mit einem besonders häufigen oder robusten Zielprotein zu tun, könnten die eingebrachten Mengen an TRIM21 sowie Antikörper limitierend wirken. Tatsächlich ist recht viel TRIM21 für den vollständigen Abbau nötig. Das wirft zwei Fragen auf: Wenn so viel TRIM21 und Antikörper erforderlich sind, wird es vermutlich Nebenwirkungen geben. Kann man TRIM21 nicht vielleicht auch als fertiges Protein zugeben, wenn der TRIM21-Bedarf die Überexpressionskapazität eines Zellsystems übersteigt?
Proteasome sind vornehmlich im Cytosol zu Hause, und auch die injizierten Antikörper dürften vor allem im Cytosol landen. Was ist also mit Zielproteinen, die sich im Kern oder anderen Kompartimenten „verstecken“? Lassen sich diese überhaupt mit der Trim-Away-Strategie erreichen? Es kommt offenbar darauf an, ob ein Zielprotein mit cytosolischen Komponenten Kontakt hat, und sei es nur vorübergehend.
So fusionierten die Forscher zum Beispiel GFP mit einem N-terminalen Myristoyl-Motiv zur Membranverankerung beziehungsweise einem NLS zum Transport in den Zellkern. Alle Varianten wurden abgebaut. Obwohl TRIM21 und der Antikörper wohl kaum den Weg in den Zellkern finden, treffen sie ihre Opfer während des Cytoplasma-Kern-Shuttlings. Das genügt, um sie zu eliminieren.
Wer sich jedoch tatsächlich fix genug im Kern verbarrikadiert, entkommt dem Schicksal der Proteolyse. Entsprechende Hinweise fanden die Forscher bei Experimenten mit Histon H2B-fusionierten GFPs. Bei intakter Zellkernhülle ist dieses im Chromatin verankerte Protein gegenüber der Knabberei durch TRIM21 gänzlich immun.
Nett wäre es dennoch, auch Proteine im Kern und anderen Kompartimenten gezielt attackieren zu können. Hierfür liefert das Forscherteam eine elegante Lösung mit Fc-gekoppelten Nanobodies. Diese funktionieren ähnlich wie herkömmliche Antikörper, sind aber wesentlich kleiner und können somit durch engmaschige Kompartimenthüllen schlüpfen. Vor ihnen können sich auch Chromatin-verankerte Zielprotein nicht länger verstecken. Den hieraus resultierenden Protein-Nanobody-Komplexen sollte der Zutritt zum Proteasom leicht fallen. Schließlich verfügen Eukaryoten auch im Kern über Proteasome.
Mit Kompartimenten, die von Natur aus proteasomfrei sind, wird aber wohl auch der Fc-Nanobody-Trick nicht funktionieren. Es sei denn, man schafft es, die Antikörper so zu gestalten, dass sie ihre Zielproteine aus einem Kompartiment rekrutieren können. Alternativ müsste man Proteasome durch Manipulation zu neuen Destinationen manövrieren.Nachdem alles mit einem einfach zu verfolgenden Fremdprotein (GFP) gut funktionierte, war TRIM-Away reif für den „echten“ Einsatz an nativen Targets. Die Wahl fiel auf das endogene Protein Eg5 aus Eizellen von Mäusen. Eg5 ist als Mikrotubulus-Motor-Protein am Spindelaufbau während der Mitose und Meiose beteiligt. Ein Defekt ist somit unmittelbar erkennbar.
Ebenso hilfreich für den direkten Vergleich: mit der Substanz Monastrol gibt es einen Eg5-Inhibitor. Und tatsächlich brachten Monastrol genauso wie die Applikation von Eg5-Antikörpern (TRIM21-exprimierende Eizellen) den Spindelbau auf ähnliche Weise gehörig durcheinander. In anti-Eg5/TRIM21-behandelten Zellen verschwand die Eg5-Bande im Immunoblot vollständig.
Trim-Away zerlegt auch hartnäckige Brocken. So gelang es den Forschern Rec8, ein Chromatin-assoziiertes Protein von Mäusen, das normalerweise monatelang intakt bleibt, in Experimenten an Eizellen auszuschalten. Eine wertvolle Erkenntnis war nebenbei, dass endogenes Rec8 für die Kohäsion von Schwesterchromatiden direkt verantwortlich ist. Kaum hatten Schuhs Mitarbeiter anti-Rec8-Antikörper zugegeben (elf Minuten nach der Mikroinjektion), verabschiedeten sich die Rec8-Proteine und die Chromatiden gingen auseinander.
Die Trim-Away-Technik hat auch therapeutisches Potenzial. Insbesondere wenn man Antikörper einsetzt, die krankhafte Varianten eines Zielproteins spezifisch erkennen und so deren Beseitigung einleiten. Den Beweis hierfür erbrachte das Forscherteam am Beispiel des Proteins Huntingtin, dessen veränderte Variante die Huntington-Krankheit auslöst. Der zum krankmachenden Huntingtin-Protein passende Antikörper lieferte nur dieses ans TRIM21-Messer, das normale Huntingtin blieb verschont.
Wer sich schon gedanklich auf eigene Trim-Away-Anwendungen eingestellt hat, kann sich über zusätzliche technische Kniffe der deutsch-englischen Gruppe freuen. Die Forscher haben im Zuge von TRIM-Away auch eine Methode entwickelt, Antikörper per Elektroporation in Zellen einzuschleusen. Das spart die Aschenputtel-Arbeit der Mikroinjektion – Zellpopulationen im Massenverfahren zu behandeln ist ungleich effizienter. Die Elektroporations-Methode ist relativ sanft und führt zu keinen erkennbaren Schäden.
Irgendwann sind die Antikörper jedoch aufgebraucht und TRIM21 oder das Proteasom erlahmen. So hielt zum Beispiel die gewünschte Beseitigung zweier Zielproteine in Zellen, die TRIM21-überexprimierten, „nur“ drei bis vier Tage an. Doch genau darin könnte auch ein Vorteil liegen, denn das System wird hierdurch reversibel. Wer keine TRIM21-überexprimierenden Zellen zur Verfügung hat oder den Aufwand scheut, diese zu generieren, kann TRIM21 auch als rekombinantes Protein herstellen und zusammen mit dem Zielprotein-gerichteten Antikörper per Elektroporation einschleusen. Das entsprechende Protokoll zur TRIM21-Produktion findet sich ebenfalls in dem Cell-Paper der Gruppe.
Manche Zelltypen verfügen von Haus aus über genügend TRIM21, sodass man gänzlich auf die exogene Zufuhr verzichten kann. Den Beweis hierfür liefern die Forscher anhand von Experimenten mit Makrophagen. Schleusten die Wissenschaftler Antikörper gegen das Signalprotein NLRP3 in die Makrophagen, wurde dieses abgebaut. In TRIM21-Knock-out-Makrophagen blieb NLRP3 jedoch unbehelligt.
Zukünftige Trim-Away-Anwender benötigen etwas Fingerspitzengefühl, weil unterschiedliche Zielproteine in verschiedenen Organismen oder Zelltypen eine individuelle Behandlung verlangen. Obendrein hängt diese auch von der Konzentration, Affinität und Stabilität des Antikörpers ab. So kann zum Beispiel der Zeitpunkt variieren, bei dem die Proteolyse in Fahrt kommt; ebenso wie die Dauer, bis TRIM21 die Luft ausgeht. Die von Schuhs Team verwendeten Zeiten und Konzentrationen sind aber gute Ausgangspunkte zum empirischen Herantasten an die Konditionen für das eigene Zielsystem.