Biochemische Routinemethoden

Von Geistern und Gelen

von Hubert Rehm

Die Wahrheit liegt im Einfachen. Das könnte von Goethe sein und in der Proteinbiochemie trifft es sogar manchmal zu. Hier drei Beispiele wie man mit verblüffend einfachen Mitteln große Wirkung erzielen, mindestens aber ein Paper machen kann.

Wenn man so in den Journalen stöbert, stößt man manchmal auf Artikel, bei denen man sich fragt, ob die Idee dahinter genial oder banal ist. Auf einen solchen stieß ich neulich in meinem Lieblingsjour-nal, in Analytical Biochemistry (2001) 297, 192-194. Die Herren oder Damen Degerli und Akpinar unterbreiten darin einen Vorschlag, wie man proteinhaltige Lösungen konzentrieren könne.

Falls Sie in Versuchung kommen, dieses Paper zu lesen, wird Ihnen zuerst das seltsame Englisch auffallen. Das liegt zum einen daran, dass Degerli kein Schweizer sondern ein türkischer Name ist, und zum anderen, dass die Editore n von Analytical Biochemistry es anscheinend nicht für nötig halten, ihre Artikel zu redigieren. Lassen Sie sich davon nicht abhalten: Mit etwas Geduld stößt man leicht zum Kern des Papers vor.


Genial oder banal?

Lange schon konzentriert man Proteinlösungen indem man sie in einen Dialyseschlauch hängt, und diesen in trockenes Sephadex steckt oder in eine konzentrierte Lösung von PEG hängt. Nach dem Gesetz der Osmose strömt das Wasser aus dem Schlauch in die PEG-Lösung und im gleichen Maße wird das Protein konzentriert. Das ist eine schonende, wenn auch langsame Methode. Die einzigen Probleme, die auftauchen können, sind undichte Dialyseschläuche und Adsorption des Proteins an den Dialyseschlauch.

Etwas schwierig wird es aber, wenn größere Volumina an Lösung zu konzentrieren sind. Dann braucht es ganze Eimer von PEG-Lösung und Riesendialysewürste. Hier greift der Einfall von Degerli und Akpinar. Die beiden drehen die Sache einfach um, schaufeln das PEG in den Dialyseschlauch und werfen den in die zu konzentrierende Lösung. Das Wasser strömt dann in den Schlauch – und wenn er sich vollgesaugt hat, zieht man ihn heraus und es ist fertig konzentriert. Aufpassen müssen Sie nur, dass Sie nicht zuviel PEG in den Schlauch geben, sonst platzt er.

Ist das nun genial oder banal?

Für den Fall, dass Sie es genial finden: Als Student habe ich am Tübinger physiologisch-chemischen Institut gelegentlich Hiwi-Dienste bei einem Herrn Placht geleistet, der dort seit sechs Jahren (oder waren’s sieben?) immer mal wieder an seiner Doktorarbeit experimentierte. Er versuchte sich an der Reinigung einer Chitinase, wobei riesige Volumina anfielen. Diese Litermengen hatte Placht damals schon nach dem obigen Verfahren konzentriert. Dies allerdings ohne Aufhebens davon zu machen oder es gar zu publizieren. Herr Placht (er schrieb sich "Pl8") hat es in der Wissenschaft dann auch nicht weit gebracht – und wir lernen daraus: Man muss grundsätzlich alles zu publizieren versuchen.

Die beiden Türken haben das Verfahren noch verfeinert. Sie haben – ausgehend von obigem Prinzip – eine kontinuierliche Konzentration entwickelt: Man lasse den Dialyseschlauch oben offen, gebe PEG hinein, und hänge den Schlauch in die zu konzentrierende Lösung. Dies natürlich so, dass das offene Ende draußen bleibt. Ist der Schlauch voll Wasser, saugen sie es ab und geben neues PEG dazu. Das kann man solange treiben bis die Brühe konzentriert genug ist.

Langwierig ist die Methode immer noch, dafür aber sicher und schonend. Und der Geist des Herrn Placht (er ist inzwischen gestorben) wird ihr Treiben mit Wohlgefallen betrachten.


Ghostbuster aus Japan

Apropos Geister. Wenn Sie die Proteinlösung soweit konzentriert haben, dass Sie mit einem Aliquot davon ein Gel fahren können, und sie färben das Gel mit Silber, dann werden Sie oft von sogenannten Geisterbanden“ belästigt. Diese Banden tummeln sich gerne im MW-Bereich 50-60 Kd.

Harald Schmidt aus Gießen hat mich auf ein Paper aufmerksam gemacht, das drei Ghostbuster“ aus Japan geschrieben haben, und das sich der Bekämpfung gerade dieser Banden widmet (Yokota et al., Analytical Biochemistry (2000) 280, 188-189.

Geisterbanden, sagen die Ghostbuster, hätten nur insofern etwas mit spiritistischen Erscheinungen zu tun, als sie beide Kopfgeburten seien. Die ersteren entstünden im Kopf, die letzteren darauf: Ursache der Geisterbanden seien Verunreinigungen mit Haut- und Haupt“-keratinen. Mit anderen Worten: Geisterbanden können ein Schuppenproblem sein.


Schuppenprobleme?

Ein naheliegendes Gegenmittel wäre ein Schuppenschampoo; allein die Erfahrung zeigt, dass dieses Mittel nicht ausreicht. Hautkeratine sind anscheinend immer und überall vorhanden und werden nicht nur vom Kopf, sondern auch von den Fingern abgesondert. Im Experimentator Proteinbiochemie/Proteomics“ wird deswegen empfohlen, bei der Entwicklung von Blots den anti-Antigen-Antikörper zuvor über Keratin-Säulen zu reinigen, aber das hilft Ihnen bei der Silberfärbung natürlich nicht weiter.

Yokota und seine Koautoren haben nun herausgefunden, dass die Keratine in den Probentaschen des Polyacrylamids sitzen: Geisterbanden erhalten Sie also schon, wenn Sie das Gel ohne Probe laufen lassen. Vielleicht haben Sie beim Gelegießen keine Handschuhe getragen, oder es ist Ihnen ein Schüppchen auf Glasplatte oder Kamm gefallen. Waschen der Taschen mit Wasser nützt wenig, waschen mit Probenpuffer vergrößert das Problem eher – vermutlich weil der Probenpuffer die Keratine ins Gel diffundieren lässt.

Die Lösung, die Yokota et al. vorschlagen besticht durch ihre Einfachheit. Sie laden die Geltaschen mit proteinfreiem Probenpuffer, elektrophoretisieren für fünf Minuten in die falsche Richtung, um die Keratine loszuwerden und entfernen dann den Probenpuffer. Die Taschen sind jetzt keratinfrei und Sie können Ihre Probe auftragen. Eine noch einfachere Methode ist, die Gele nicht mehr selber zu gießen, sondern vorgegossene Gele zu kaufen. Die werden maschinell hergestellt und sollten daher keratinfrei sein. Hundertprozentig verlassen kann man sich darauf allerdings nicht.

Geltaschen geputzt oder Gel gekauft: Die Geisterbanden verschwinden natürlich nur dann, wenn sowohl Probenpuffer als auch Lauf- und Gelpuffer keratinfrei sind. Letztendlich werden Geisterbanden nur durch sorgfältiges Arbeiten vertrieben, und vielleicht sollte man sogar mal wieder den Laborkittel waschen.


Warum denn blotten, wenns auch ohne geht?

Sie haben das Protein konzentriert, Sie haben damit ein Gel gefahren, der nächste Schritt ist – Geisterbanden oder nicht – im Gel ein Antigen nachzuweisen. Das macht man üblicherweise per Westernblot.

So ein Westernblot hat Nachteile. Es ist ein zusätzlicher Schritt, die Bandenauflösung verschlechtert sich etwas, durch die Adsorption an die Blotmembran können Renaturierungsvorgänge verhindert werden, und die Übertragung ist selten quantitativ: Manche Proteine bleiben zum Teil im Gel, wieder andere bleiben nicht quantitativ auf der Blotmembran hängen.

Warum eigentlich führt man die Immunodetektion nicht direkt im Gel aus? Die Antwort war bisher: Weil es ewig dauert, bis die Antikörper ins Gel diffundiert sind.

Desai et al. haben hinter diese Antwort ein Fragezeichen gesetzt (Analytical Biochemistry (2001) 297, 94-98). Sie behandeln das Gel mit 50% Isopropanol und danach mit Wasser und behaupten, dass sich das Gel dann hervorragend mit Antikörpern anfärben ließe. Die Vorbehandlung mit Isopropanol/Wasser öffne die Poren des Gels, sodass Antikörper eindringen könnten. Das leuchtet ein, denn unter Isopropanol schnurrt das Gel ein und unter Wasser bläht es sich auf und dies kann den Poren nicht gut tun.

Entwickelt wird das Gel wie der Blot, nur dass Sie sich das Blocken schenken können. Also: Inkubieren mit erstem Antikörper für 1 h, dreimal waschen, inkubieren mit zweitem Antikörper für 1 h, dreimal waschen, dann entwickeln. Erstaunlicherweise ist die Empfindlichkeit vergleichbar mit der einer Immundetektion auf dem Blot. Für die Färbung im Gel brauche man allerdings drei bis 14 Stunden weniger versichern die Autoren. Zudem sollen im Gel Hintergrundsfärbung und unspezifische Bindung des Antikörpers geringer sein. Ein weiterer Vorteil des Gels ist, dass es auf zwei Seiten angefärbt werden kann.

Tatsächlich scheint an der Methode etwas dran zu sein, denn sie wird inzwischen unter dem Namen Unblot kommerziell vertrieben (von Perbio Science siehe Laborjournal 6/2001, S. 55).

Dennoch, so ganz kann ich mich mit der Methode nicht anfreunden. Wenn ich das Paper richtig gelesen habe, dann wird das Gel nach der Elektrophorese nicht fixiert. Die Isopropanol-Behandlung mag zwar die meisten Proteine ausfällen, aber vermutlich nicht alle. Die könnten aus dem Gel herausdiffundieren oder wenigstens werden sich beim Inkubieren ihre Banden verbreitern. Des weiteren halte ich lieber ein Stück Blotmembran in der Hand als ein schlabbriges Gel. Blotmembranen lassen sich auch länger und problemloser aufbewahren.

Vielleicht sollte man zum Isopropanol noch etwas Essigsäure oder TCA geben? Probieren Sie es aus, und schreiben Sie Ihre Erkenntnisse an: hr@laborjournal.de




Letzte Änderungen: 08.09.2004