Konzentrationsbestimmungen mit dem Photometer I

DNA ist eine Frage fehlenden Durchblicks

von Ccornel Mülhardt

Angesichts der politischen Weltwetterlage ist Cornel Mülhardt der Spass vergangen. Aber lesen Sie besser selbst, warum er dieses Mal ausgerechnet über die DNA-Bestimmung per Fotometer sinniert...

Liebe Leser, normalerweise ist der Vorspann irgendeinem Unsinn gewidmet, aber in diesen Tagen, da im Irak noch geschossen wird, geht mir leider wenig Lustiges durch den Kopf. Hatte ich doch in meiner jugendlichen Unschuld gedacht, militärische Überfälle seien ein Kennzeichen verdammenswerter Diktaturen, und jetzt zeigt sich, dass es gerade die Politiker sind, die sonst am vehementesten die christlichen Werte auf den Lippen führen, die nun am wenigsten Probleme damit haben, Menschen umbringen zu lassen, und das noch im Namen der Freiheit! Man könnte meinen, Jesus Christus habe nie gelebt.


Rückfall ins dunkle Mittelalter

Passend zu diesem Rückfall ins dunkle Mittelalter möchte ich mich daher heute einer altväterlichen und vielfach reichlich unbeliebten Methode widmen, der Konzentrationsbestimmung von DNA mittels Absorptionsspektrometrie – Sie wissen schon, die Sache mit dem Photometer da. Ich kannte mal einen, dem war die Methode so unlieb, dass er am Ende einer DNA-Maxipräp die Konzentration einfach per Order de Mufti definierte, der schlichten Überlegung folgend, dass er ja alles richtig gemacht hatte und auf dem Kit ohnehin draufstand, was dann herauskommen müsse.

Probleme damit hatten nur die Kollegen, denen er freundlicherweise gelegentlich DNAs weiterreichte, bis endlich mal jemand auf die Idee kam, selbst nachzumessen. Womit wir auch schon bei einer dieser fundamentalen, leider viel zu selten niedergeschriebenen Regeln der Molekularbiologie wären: Schreiben Sie nur Konzentrationsangaben auf das Gefäß, wenn Sie sie in irgendeiner Form zuverlässig bestimmt haben. Zu diesem Zweck wurde übrigens das Gerät mit der UV-Lampe gekauft, das in irgendeiner Ecke Ihres Labors ein Schattendasein fristet.

Ich weiß, die Dinger bereiten klassischerweise jede Menge Schwierigkeiten, angefangen beim Anschalten. Beim Motorrad drückt man auf den Anlasser und fährt los. Beim Photometer drückt man auf den Einschaltknopf und geht erst mal wieder. Im Gegensatz zur einfachen Glühbirne, die ziemlich schnell hell wird, braucht die klassische UV-Lampe nämlich fünf bis zehn Minuten, bis sie warmgelaufen ist und in vollem Glanz erstrahlt.

Früher wusste das jeder, doch seitdem Geräte mit alternativen Messprinzipien den Markt erobern, die auch ohne nennenswerte Aufwärmphase auskommen, kann man schon mal ins Schleudern kommen, wenn man mit fremden Geräten arbeitet. Das Problem ist, dass man den Fehler gar nicht so leicht erkennt, weil das Photometer in jedem Fall ein Ergebnis ausspuckt.


Der Mehrfachmessungs-Trick

Eine einfache Methode, derlei Fehler zu vermeiden, ist die Mehrfachmessung. Messen Sie die gleiche Küvette gleichen Inhalts einfach drei Mal hintereinander. Unterscheiden sich die Werte kaum, kann man ihnen wohl trauen, steigen sie beispielsweise von Messung zu Messung an, dann haben Sie ein Problem, dem sie sich lieber gleich widmen sollten und nicht erst, wenn Sie vor den Trümmern eines zweitägigen Versuchs stehen. Im Laufe der Zeit werden Sie dann auch ein Gefühl dafür bekommen, welche Messschwankungen noch normal sind und welche bedenklich sein können. Unterschiede zwischen den Messergebnissen werden sie nämlich immer haben, daran ändert auch die Tatsache nichts, dass Ihr Photometer drei Stellen hinter dem Komma anzeigt.



Elektronische Störeffekte, Schwankungen in der Lichtintensität der Lampe, das Spiel der Küvettenhalterung, dies und noch viel mehr führt nämlich dazu, dass drei unabhängige Messungen der gleichen DNA-Lösung ihnen drei ähnliche, aber nicht identische Messwerte liefern werden. Dies macht sich besonders bei kleinen Messwerten bemerkbar: OD 0,05 +/- 0,01 bedeutet in der Praxis, dass die einzelnen Messwerte sich zwischen 0,04 und 0,06 bewegen, was einen gehörigen Unterschied ausmacht. Deswegen rät man, kleinen OD-Werten nicht zu trauen, wobei die Grenze für klein“ nicht genau definiert ist – ich setze sie bei 0,1 an, andere Autoren bei 0,05. Wer eine rationale Definition für diese Untergrenze kennt, möge sich doch bitte bei mir melden.

Aber auch hohe OD-Werte sind häufig falsch, und das hat seinen Grund in der Mathematik, die dahinter steckt. Das Lambert-Beersche Gesetz kennen Sie, aber nur noch dem Namen nach? Willkommen im Klub. Dabei ist die Sache eigentlich recht simpel: Bei der Absorptionsmessung wird gemessen, wieviel vom Licht einer bestimmten Wellenlänge (im Fall von Nukleinsäuren sind das 260 nm) auf dem Weg durch die Küvette verschwindet. Das Licht verschwindet natürlich nicht einfach so, sondern wird von den Basen der Nukleotide absorbiert und als Licht mit größerer Wellenlänge wieder abgestrahlt.


Wenn Licht verschwindet...

Da aber nur Licht von 260 nm auf der anderen Seite der Küvette gemessen wird, sieht es aus, als verschwinde das Licht einfach so. Dieser Verlust an Licht wird im Deutschen als Absorption oder Extinktion, im Englischen als absorbancy oder optical density bezeichnet (von letzterem leitet sich dieses mysteriöse Kürzel O.D. ab) und errechnet sich aus dem Logarithmus des Quotienten aus eingesetzter Lichtintensität I0 und nach dem Durchtritt durch die Küvette gemessener Lichtintensität I, also log(I0/I).

Der Logarithmus ist eine originelle Kurve, die quasi aus der negativen Unendlichkeit kommt, am Punkt x=1 die Abszisse schneidet, also den Wert Null hat, und sich anschließend ganz langsam in Richtung Unendlichkeit verabschiedet. Der Quotient I0/I kann im allerschlechtesten Fall 1 betragen, wenn nämlich kein Licht absorbiert wurde und die einfallende Lichtintensität und die ausfallende gleich groß sind, womit der kleinste Wert, den die Absorption einnehmen kann, Null wäre (da log I0/I0 = log 1 = 0). Wie, ihr Photometer spuckt gelegentlich negative Werte aus? Kein Panik. Rein mathematisch bedeutet dies, dass Sie in Ihrer Küvette Licht generiert haben, in der Praxis bedeutet es dagegen meistens, dass man einen neuen Nullabgleich machen und die letzten Werte noch mal nachmessen sollte.

Die Absorption kann also nicht kleiner werden als Null, aber wie groß kann sie maximal sein? Stellen Sie einfach eine schwarze Küvette in das Gerät – und sie werden doch keine Antwort darauf erhalten, weil die Anzeige einfach streikt! Wird alles Licht absorbiert, lautet der Quotient I0/0, was gemeinhin als unendlich bezeichnet wird, und der Logarithmus von unendlich ist unendlich, existiert also nicht – daher die seltsame Anzeige.

Doch auch viel kleinere OD-Werte haben ihre Tücken. Die Logarithmuskurve flacht zunehmend ab, je größer die Werte werden, ist also alles andere als linear. De facto bedeutet das: Bei einem OD-Wert von 0 wurde 0 % des Lichtes absorbiert, OD 1 steht für eine 90-prozentige Absorption (weil 1 = log 10 = log (1/0.1), folglich trat nur noch 10 % des einfallenden Lichtes aus der Küvette aus), OD 2 bedeutet 99%ige Absorption und OD 3 gar 99,9 Prozent.


Finger weg von O.D. >1

Man kann aus diesen Zahlen leicht ersehen, dass im hohen OD-Bereich kleine Messfehler große Auswirkungen auf den OD-Wert haben: 97 % Absorption bedeutet OD 1,5, 98 % bedeutet OD 1,7 und 99 % ergibt OD 2,0 – dabei beträgt der Unterschied bei der Absorption jeweils nur 1 %! Womit hoffentlich anschaulich erklärt wäre, weshalb Ihr Photometer zwar keine Probleme hat, Werte über 1,0 anzuzeigen, Sie aber von solchen Werten lieber die Finger lassen sollten. Andere Autoren setzen die Obergrenze bei 1,5 an – Ansichtssache. Probieren Sie es selbst aus: Messen Sie eine DNA-Lösung mit einem OD-Wert zwischen 1 und 2 drei Mal, verdünnen Sie sie anschließend auf die Hälfte und messen Sie sie nochmals. Ergibt die zweite Messreihe tatsächlich eine halb so große DNA-Konzentration wie die erste?

Viel Spaß beim Pipettieren. Im nächsten Artikel werden wir uns dann ein paar weiteren interessanten Aspekten der Absorptionsmessung widmen – und außerdem der Frage nach der Lyophilisierung von Bakterien nachgehen, die ein ganz erstaunliches Leserecho ausgelöst hat. Post bitte an: cornel.muelhardt@web.de




Letzte Änderungen: 08.09.2004