Proteinseparation mit Affinität-Tags, Teil 2

Die Sonne bringt es an den Tag

Kay Terpe

Kleine Affinitäts-Tags werden häufig eingesetzt, um Fusionsproteine zu isolieren. Die Stärken und Schwächen dieser Tags sind aber weniger geläufig.

Im ersten Teil der Proteinseparation mit Affinitäts-Tags (Laborjournal 6/2004) beschäftigten wir uns mit den Regeln für das ideale System (es gibt keines!) und den Expressionsbedingungen. Hier geht es um die Tags selbst, um kleine Tags. Kleine Tags sind Polypeptide mit einer maximalen Länge von zwölf Aminosäuren oder 1,5 kDa Größe. Hierzu zählen: Das Arg-Tag, c-Myc-Tag, Flag-Tag, His-Tag und Strep-Tag.

Schon 1984 wurde das Arg-Tag beschrieben. Es besteht aus fünf bis sechs Arginin-Resten. Mit seinem pK-Wert von 12 ist Arginin eine basische Aminosäure. Proteine mit Arg-Tag können also oft über Kationen-Austauschchromatografie (beispielsweise mit SP-Sephadex) gereinigt werden. Die meisten bakteriellen Proteine dagegen sind schwach sauer und binden nur schlecht an SP-Sephadex. Eluiert wird mit einem Koch-salzgradienten von Null bis 300 mM bei alkalischem pH. Leider eluieren dabei auch viele unerwünschte Proteine. Zudem kann ein C-terminales Arg-Tag die Tertiärstruktur eines Proteins beeinflussen, wenn der C-Terminus hydrophob ist. Dennoch hat sich Ende der 90-er Jahre eine interessante Anwendung für das Arg-Tag eröffnet. Arg-getaggte Proteine binden reversibel an Oberflächen und dies ermöglicht die Untersuchung ihrer Wechselwirkung mit Bindungspartnern.

Ein Tag folgt auf das andere

Das c-Myc-Tag ist kein klassisches Affinitäts-Tag, da es auf der Interaktion eines Epitops und des Immunglobulins 9E10 basiert. Das Tag wurde 1985 das erste Mal beschrieben und hat die Sequenz EQKLISEEDL. Es wird gerne für Western-Blots, Immunopräzipitation oder Flow Cytometrie eingesetzt. Auch lassen sich damit Proteine in Bakterien, Hefen, Insekten Zellen und Säuger-Zellen nachweisen. Für die Proteinreinigung wird das Tag selten genutzt, da man das Fusionsprotein über einen pH-Shift ins Saure eluiert und dies viele Proteine mit dem Tod quittieren.


Schonend Proteine putzen

Das Flag-Tag wurde 1988 beschrieben und besteht aus acht Aminosäuren der Sequenz DYKDDD-DK. Es kann sowohl N- als auch C-terminal fusioniert werden und bindet an die Antikörper M1, M2 und M5. Die Bindung ist kalziumabhängig. Eluiert wird bei pH 3 oder mit 2 bis 5 mM EDTA. Achtung! In diesem Fall hat EDTA im Waschpuffer nichts zu suchen. Viele geben ja EDTA als Proteaseinhibitor zu den Puffern. Hier nicht! Hier müssen Sie’s knabbern lassen.

Der Vorteil des Flag-Tags ist: Sie können unter physiologischen Bedingungen reinigen. Ein weiterer Vorteil ist, dass die letzten 5 C-terminalen Aminosäuren DDD-DK von der Enterokinase erkannt und gespalten werden. Um den Nachweis des Flag-Tags zu verbessern, wurde ein 3 x Flag-Tag System entwickelt. Dieses 3-Tandem Flag-Epitop ist hydrophil, 22 Aminosäuren lang und ermöglicht den Nachweis von zehn fmol exprimiertem Protein.Mit der Flag-Tag-Chromatographie wurden schon aus Bakterien, Hefe und Säuger-Zellen Fusionsproteine isoliert. Die Matrix mit dem immobilisierten Antikörper ist allerdings nicht so stabil wie NTA-, CMA-, IDA-Säulen oder Strep-Tactin. Dies sollten Sie bedenken, wenn Sie dem Wasch- oder Elutionspuffer etwas zusetzen.


Der Klassiker: Das His-Tag

Schlägt man Kristallographie-Zeitschriften auf, kann man sich schnell überzeugen, dass viele Proteine immer noch mit dem Poly-His-Tag gereinigt werden. Grundprinzip ist IMAC: Immobilized Metal Affinity Chromatography. Zweifach positiv geladene Kationen wie Cu2+, Ni2+, Co2+, Zn2+ werden über einen chelierenden Liganden an eine Matrix immobilisiert und interagieren mit den Seitengruppen der Histidine. Die IMAC wurde schon 1975 beschrieben, hat sich aber erst seit der Publikation von Hochuli im Jahre 1987 durchgesetzt. Meist werden Proteine mit fünf oder sechs Histidinen fusioniert, an die Matrix gebunden und dann mit 250 mM Imidazol eluiert.

Oh, bei Ihnen eluiert nichts? Dann waren die Elutionsbedingungen zu schwach. Setzen Sie dem Elutionspuffer 8 M Harnstoff oder 6 M Guanidinhydrochlorid zu und Sie werden schnell ein sauberes rekombinantes Protein bekommen. Leider ein denaturiertes.


Ansprüche haben die Leute!

Soll die native Konformation erhalten bleiben – Ansprüche haben die Leute! – müssen Sie mit den Imidazolkonzentrationen im (physiologischen) Wasch- und Elutionspuffer spielen. Sie fahren zum Beispiel einen Gradienten von 2 bis 1000 mM Imidazol. Haut das nicht hin, versuchen Sie durch die Länge des Tags die Bindeeigenschaften zu beeinflussen. His4-Tags binden deutlich schwächer als His10-Tags. Zudem ist die Affinität der Matrix abhängig davon, welche Kationen in die Matrix eingebunden sind. Cu2+ zeigt schwache Affinität, Ni2+ und Co2+ eine bessere. Eine weitere Alternative bieten Zn2+-Ionen. Neben den immobilisierten Metallionen hat der chelierende Ligand Einfluss auf die Adsorption. TED hat die schwächste Adsorption, NTA und CMA eine deutlich bessere und IDA die stärkste.

Und noch ein Problem: Proteine, die ebenfalls mehrere Histidine in kurzen Abständen enthalten, werden auch an die Matrix gebunden und mit eluiert. Um dies zu verhindern, können Sie dem Waschpuffer 10 mM oder mehr Imidazol zusetzen. Allerdings kann dann während des Waschens ein Teil des erwünschten Proteins von der Säule gewaschen werden. Die Ausbeute wird also geringer. Wie so oft im Leben sind auch hier Fingerspitzengefühl und Erfahrung gefragt.

Probieren statt studieren

Welche Metallionen und welcher chelierende Ligand am besten sind, hängt vom Protein ab und muß empirisch festgestellt werden. Probieren geht über studieren.

Das His-Tag wird kommerziell in Expressionssystemen wie Bakterien, Hefe, Insektenzellen oder Säuger-Zellen eingesetzt. Allerdings kann das His-Tag mit dem Fusionsprotein interagieren. Sollte dies der Fall sein, muss das Tag an den anderen Terminus des Proteins geknüpft werden. Auch eignet sich die IMAC nicht, um Proteine unter anaeroben Bedingungen zu isolieren, da das Metallion reduziert wird. Des weiteren kann bei der Isolation von Metalloproteinen das Metall an die Matrix gebunden werden.

Nein, ich bin noch nicht fertig! Höchstens mit den Nerven. Das StrepTag fehlt noch.

Dieses Tag wurde 1993 zum ersten Mal beschrieben. Es handelt sich um ein acht Aminosäuren langes Peptid mit der Sequenz WSHPQFEK. Kern des Peptids ist die Histamin-Prolin-Glutamin-Sequenz. Das Tag bindet in der Biotin-Bindetasche von Streptavidin. Durch Mutationsexperimente wurde eine Streptavidinvariante namens Strep-Tactin entwickelt, die eine deutlich bessere Affinität gegenüber dem Strep-Tag hat.

In der Regel wird mit 2,5 mM Desthiobiotin eluiert, um danach die Säule mit einem Azofarbstoff zu regenerieren. Bei der Regeneration der Säule schlägt die Farbe von gelb nach orange um. Biotin sollte nicht verwendet werden, da man damit zwar eluieren, aber nicht mehr regenerieren kann. Die Bindung ist spezifisch und die Pufferbedingungen können dem System angepasst werden. Einzig und allein denaturierende Bedingungen sind ungeeignet. Eine Reinigung unter anaeroben oder halophilen Bedingungen ist möglich und nicht-ionische, ionische und zwitter-ionische Detergenzien sind mit dem System kompatibel. Die Variabilität der Pufferbedingungen macht das Strep-Tag interessant für Protein-Protein Interaktion oder Reinigung von Metallo- sowie Membranproteinen.

Eingesetzt wird das Strep-Tag wo? Richtig: In Bakterien, Hefen, Insekten, Pflanzen und Säuger-Zellen.


Nichts Genaues weiß man nicht

Im dritten und letzten Beitrag werde ich mittellange und lange Affinitäts-Tags vorstellen. Die Lehre aus den bisherigen ist: Die Affinitätschromatographie ist eine empirische Angelegenheit und man kann nicht vorhersagen, welches Tag sich für welches Protein eignet. Es gibt allerdings Bestrebungen, die Daten der überexprimierten und gereinigten Proteine in einer Bank zu sammeln, um so die Einsetzbarkeit der Tags und Expressionssysteme besser abschätzen zu können.

Für Kritik und Anmerkungen bitte an k.terpe@t-online.de mailen.



Letzte Änderungen: 05.10.2004