Bakterielle Protein-Expressionssysteme

Lieber Lotto spielen

Kay Terpe

Ganz schön unübersichtlich, die Vielzahl der Systeme, mit denen man "sein" Protein herstellen kann. Unser Autor Kay Terpe hat für Sie aufgeräumt und liefert einen Überblick über die gängigsten bakteriellen Protein-Expressionssysteme.

In den Laborjournal-Ausgaben 6, 9 und 10/2004 ging es um die verschiedenen Affinitäts-Tags, die zur heterologen Proteinexpression und -reinigung eingesetzt werden können. Nun sind die Tags nicht alles; entscheidend für eine schnelle und erfolgreiche Proteinanreicherung ist auch die Auswahl des Expressionssystems. In den letzten Jahren sind viele Expressionssysteme entwickelt worden. Durch die Genomsequenzierungs-Projekte hat sich die Entwicklung noch beschleunigt.

Man unterscheidet die Expressionssysteme nach den Wirten, in denen die Proteine überexprimiert werden: Bakterien, Hefen, andere Pilze, Insektenzellen, Mammalia-Zellen, Pflanzen oder Tiere.

Am häufigsten werden Bakterien als Wirte eingesetzt, denn Bakterien sind einfach zu manipulieren. Zudem ist die Kultivierung nicht aufwändig und die Kosten sind im Vergleich zu beispielsweise Mammalia-Zellen geringer. Dennoch macht auch die Expression in Bakterien häufig Schwierigkeiten, wobei jedes Protein seine eigenen Probleme schafft. Sie können es mit Autos vergleichen: Eine Isetta ist wesentlich einfacher aufgebaut als ein 5er-BMW und dennoch - oder gerade deswegen - bleiben Sie mit der Isetta öfter liegen.

Die Pannen bei Bakterien sind: Man erhält kein Protein oder aber so viel Protein, dass es in Einschlusskörperchen akkumuliert. Diese unerwünschten Inclusion-Bodies lassen sich zwar leicht aufreinigen. Doch ist es schwer, daraus wieder aktive Proteine herzustellen. Zudem glykosilieren Bakterien nicht. Sollte die Glykosilierung also für die Aktivität eines Proteins entscheidend sein, müssen Sie auf Mammalia- oder Insektenzellen ausweichen.


Altbekanntes Haustierchen

Der am häufigsten eingesetzte bakterielle Wirt ist nach wie vor E. coli. In ihm werden verschiedene induzierbare Promoter-Systeme eingesetzt. Am bekanntesten dürften die Promotorsysteme des Bakteriophagen T7 und des trc-Hybrids sein. Beide Systeme werden durch die lac-Gene reguliert und durch IPTG induziert. IPTG ist teuer und daher auch die induzierbare Überexpression. Das T7-System bildet große Mengen an Protein, was häufig zu Inclusion-Bodies führt. Mit dem trc-Hybrid-System dagegen erhält man moderate Mengen an rekombinantem Protein. Manchmal sehr moderate Mengen. Wie so oft im Leben gilt es, den Mittelweg zwischen Gier und übermäßiger Bescheidenheit zu finden.

Neben IPTG-Systemen werden Zucker-induzierbare Systeme eingesetzt. Erwähnenswert ist die Induktion durch Arabinose und Rhamnose. Beide Systeme lassen sich gut regulieren, so dass man sowohl hohe als auch niedrige Expressionsraten erzielen kann. Was Praktiker mit schmaler Geldbörse besonders freut: Im Vergleich zu IPTG sind diese Zucker billig.


E. coli bleibt halt E. coli

Beim Tet-System wird mit dem nicht toxischen Tetracyclinderivat Anhydrotetracyklin induziert. Der Vorteil: Es gibt vor der Induktion keine Grundexpression an rekombinantem Protein.

Eine Alternative zu Inducer-Systemen bietet das Temperatur sensitive PL-System. Es induziert durch einen Temperatursprung auf 42 °C. Man spart also den Inducer, benötigt aber einen Temperatur sensitiven E. coli-Stamm.

Neben verschiedenen Induktionssystemen wurden auch E. coli-Stämme entwickelt, die andere Probleme beheben sollen. Nun sind diese Probleme beinahe so zahlreich wie die Zahl der Proteine multipliziert mit der Zahl der Forscher. Darauf einzugehen würde den Rahmen dieses Beitrags sprengen. Es würde auch nicht viel nützen, denn es gibt es viele Proteine, die sich in E. coli nicht überexprimieren lassen. E. coli bleibt halt E. coli.


Viel Quantität, wenig Qualität

Es herrscht daher eine rege Nachfrage nach alternativen bakteriellen Expressionssystemen. Ein kaum bekanntes Gram-negatives Bakterium namens Caulobacter crescentus wird seit 1998 zur Proteinexpression eingesetzt. Caulobacter kommt normaler Weise in Umweltgewässern vor und ist ein Modellorganismus, an dem die Regulation des bakteriellen Zellzyklus‘ studiert wird. Zur Überexpression wird den Fusionsproteinen ein C-terminales RsaA-Sekretions-Signal angehängt. Damit lassen sich Proteine bis zu einer maximalen Größe von 450 Aminosäuren überexprimieren. Die Fusionsproteine werden durch einen hydrophilen Kanal, der sowohl die innere als auch die äußere Membran durchzieht, ins Medium exportiert. Leider liegen die RsaA-Fusionsproteine dort nicht nativ, sondern als Aggregate vor. Man muß sie solubilisieren. Auch wird ein Teil der sekretierten Proteine proteolytisch verdaut. Zudem hat man ein RsaA-Anhängsel von ca. 36 kDa. Mit einer Kopienzahl von 40.000 pro Zelle ist das System aber dennoch interessant für Peptide und kleine Proteine.
Alternative: Bacillus

Eine weitere Alternative bieten die Gram-positven Bakterien. Im Gegensatz zu Gram-negativen Bakterien besitzen sie keine Außenmembran, sondern nur eine Zytoplasmamembran und eine stark ausgebildete Zellwand.

Verschiedene cytoplasmatische und sekretorische Expressionssysteme sind mit Gram-positiven Bakterien schon gut untersucht und werden für die Proteinexpression eingesetzt. Erstaunlicher Weise haben genauere Analysen gezeigt, dass die Exportapparate Gram-positiver Bakterien dem von E. coli ähneln.

Ein deutlicher Vorteil der Gram-positiven gegenüber Gram-negativen Systemen ist der Wegfall der Lipopolysaccharide (LPS). Die sitzen bei Gram-negativen Bakterien auf der Außenmembran und da Gram-positive Bakterien keine Außenmembran besitzen, werden während der Proteinreinigung auch keine LPS angereichert. LPS sind Endotoxine, die eine starke Immunantwort hervorrufen. Diese Immunantwort kann die verschiedensten Tierapplikationen beeinflussen. Bei der pharmazeutischen Produktion von rekombinanten Proteinen ist es daher wichtig, die LPS-Konzentration so niedrig wie möglich zu halten.

Seit 1988 ist das induzierbare sekretorische System von Bacillus subtilis im Einsatz. Das Proteinexpressionssystem zeichnet sich durch starke Sekretion aus. Gleichzeitig werden jedoch große Mengen von Proteasen ins Medium abgegeben. Dieses Problem wurde durch die kontinuierliche Entwicklung von Protease negativen Mutanten gelöst. Während bei Stamm WB30 im Jahr 1988 erst zwei Proteasen ausgeknockt waren, hatte Stamm WB600 sechs, WB700 sieben und im Jahr 2000 WB800 acht Proteasen verloren. WB800 wird derzeit zur Produktion von Proteinen eingesetzt. Die Induktion erfolgt mit der billigen Sucrose. Die Sekretion erleichtert die Reinigung; auch werden keine Inclusion-Bodies gebildet. Und noch ein Zuckerl: Der Organismus ist kinderleicht zu handhaben.


Gigantische Mengen mit Bacillus megatherium?

Ein weiteres Bacillus-System, das heterolog Proteine in großen Mengen produziert, wurde 1991 beschrieben. Der Wirt dieses Systems ist mit 4 µm Größe der Gigant unter den Bacilli und heisst Bacillus megaterium. Ein induzierbares System mit Xylose liefert eine bis zu 350-fache Induktion und einen zeitlich befristeten Schutz vor Proteolyse. Um die Transformationsrate zu steigern, ist es ratsam, mit Protoplasten zu arbeiten. Dies erschwert allerdings den Einstieg.

In Europa wenig bekannt ist das in Japan entwickelte sekretorische Expressionssystem von Bacillus brevis. Es bietet ähnliche Vorzüge wie B. subtilis oder B. megaterium.

Es ist anzunehmen, dass durch Bacillus-Genomprojekte immer mehr Proteinexpressionssysteme mit unterschiedlichen Bacillus-Wirten entwickelt werden. Die Pharmaindustrie hat Interesse an Systemen, die nicht durch Patente blockiert werden.

Seit neuestem wird Staphylococcus carnosus zur Proteinproduktion eingesetzt. Wie B. subtilis sekretiert auch er große Mengen lösliches rekombinantes Protein in den Zellkulturüberstand. Die Proteine liegen daher relativ sauber vor. Solubilisieren oder Renaturieren ist nicht notwendig und auch die Reinigung wird erleichtert.


Fazit: Lieber öfter mal Lotto spielen!

Bei der Wahl des richtigen bakteriellen Expressionssystems haben Sie also die Qual der Wahl. Das ideale System gibt es nicht, alle haben sie ihre Vor- und Nachteile. Auf unerwartete Probleme kann man bei jedem System stoßen. Vielleicht sollte man lieber öfters einen Lottoschein ausfüllen. Denn wenn‘s mit der Proteinaufreinigung nicht klappt, so klappt es vielleicht wenigstens mit dem monetären Hauptgewinn. Jedenfalls wünscht Ihnen das Ihr Kay Terpe.

Letzte Änderungen: 01.03.2005