Tipp 47:
Reinigung von dsDNA mit Guanidinhydrochlorid
Schlechte Zeiten fürs Agarosegel

Verdauen, reinigen, klonieren. Verdauen, reinigen, klonieren. Verdauen – ok, ist ja gut! Die alltägliche Seite des Molekularbiologen-Tagwerks ist definitiv nicht Hollywood-konform. Einfach zu viele Langweiler-Einheiten. LJ-Autor Kay Terpe findet das auch: Er hat sich seiner Doktoranden-Schandtaten erinnert und beschreibt einen Trick, der die dröge v-r-k-Prozedur abkürzt:

Um DNA-Fragmente in einen Vektor zu klonieren, muss man meistens unerwünschte Fragmente der Multi-Kloning-Site (MCS) entfernen. In der Regel wird die verdaute DNA im Agarosegel getrennt und anschließend ein Agarosebrocken mit dem gewünschten Fragment ausgeschnitten. Fürs Ligieren muss die DNA wieder in Lösung gebracht werden. Hierfür gibt es die verschiedensten Methoden: Zentrifugation durch Whatman-3MM-Papier, Elektroelution, Absorption an Silica-Gel"-Membranen, Absorption an Glasmilch, Low Melting Point Agarose und Einsatz von Agarase.

Welchen Einfluss die jeweiligen Methoden auf die DNA oder auf die Effizienz der Ligation haben, ist in den meisten Fällen unklar. Zudem kosten der Lauf des Agarosegels und die anschließende Reinigung viel Zeit. Oft habe ich mir die Frage gestellt, wie man die Gel-Auftrennung umgehen kann. Eine Lösung habe ich gefunden: Im Prinzip benötigt man nur QIAGENs Qiaquick PCR Purification-Kit und etwas Guanidinhydrochlorid. Vergleichbare Kits gleichen Säulenmaterials von anderen Firmen sind wohl auch einsetzbar, habe ich aber nicht getestet.

Im Prinzip wurden diese Kits entwickelt, um Primer von PCR-Fragmenten abzutrennen. Wenn man aber sehr lange Primer hat, sollte man vor der Elution der Ziel-DNA einen zusätzlichen Reinigungsschritt mit 35 % Guandinhydrochloridlösung einbauen. Diesen Schritt kann man nutzen, um kurze, doppelsträngige und damit unerwünschte DNA der MCS abzutrennen. Es empfiehlt sich, die unerwünschte MCS durch zusätzliche Restriktionsenzyme (RE) zu verdauen, um das Risiko Religation" zu vermeiden.

Meist führt man einen Verdau mit 3 REs durch. Mit zwei Enzymen öffnet man den Vektor, mit einem weiteren zerschneidet man die MCS (Kompatibilität der Puffer checken, um vollständigen Verdau zu gewährleisten!). Zudem sollten die dsDNA-Fragmente der unerwünschten MCS nicht länger als 35 Basen sein. Ist die Planung abgeschlossen, kann man an einem Tag den Vektor verdauen (1 h), reinigen (30 min), ligieren (1-4 h) und transformieren (1 h). Für eine Mittagspause bleibt auch noch Zeit.

Am nächsten Morgen erhält man dann seine Klone. Bei 10-40 % der Klone handelte es sich in meinem Fall immer um die gewünschten und das, obwohl ich mit 7 kb großen Vektoren gearbeitet habe. Zu meiner aktiven Laborzeit hat sich mein Chef immer wieder gewundert, wie schnell ich klonieren würde..."


Letzte Änderungen: 08.09.2004